NORMA
Oficial Mexicana NOM-247-SSA1-2008, Productos y servicios. Cereales y sus
productos. Cereales, harinas de cereales, sémolas o semolinas. Alimentos a base
de: cereales, semillas comestibles, de harinas, sémolas o semolinas o sus
mezclas. Productos de panificación. Disposiciones y especificaciones sanitarias
y nutrimentales. Métodos de prueba.
Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.- Secretaría de Salud.
NORMA OFICIAL MEXICANA
NOM-247-SSA1-2008, PRODUCTOS Y SERVICIOS. CEREALES Y SUS PRODUCTOS. CEREALES,
HARINAS DE CEREALES, SEMOLAS O SEMOLINAS. ALIMENTOS A BASE DE: CEREALES,
SEMILLAS COMESTIBLES, DE HARINAS, SEMOLAS O SEMOLINAS O SUS MEZCLAS. PRODUCTOS
DE PANIFICACION. DISPOSICIONES Y ESPECIFICACIONES SANITARIAS Y NUTRIMENTALES. METODOS
DE PRUEBA.
MIGUEL ANGEL TOSCANO VELASCO,
Comisionado Federal para
CONSIDERANDO
Que en cumplimiento a lo
previsto en el artículo 46 fracción I de
Que con fecha 2 de junio de
2008, en cumplimiento del acuerdo del Comité y lo previsto en el artículo 47
fracción I, de
Que con fecha previa, fueron
publicadas en el Diario Oficial de
Que en atención a las
anteriores consideraciones, contando con la aprobación del Comité Consultivo
Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, se expide la
siguiente:
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-247-SSA1-2008, PRODUCTOS Y SERVICIOS. CEREALES Y SUS PRODUCTOS. CEREALES, HARINAS DE CEREALES, SEMOLAS O SEMOLINAS. ALIMENTOS A BASE DE: CEREALES, SEMILLAS COMESTIBLES, DE HARINAS, SEMOLAS O SEMOLINAS O SUS MEZCLAS. PRODUCTOS DE PANIFICACION. DISPOSICIONES Y ESPECIFICACIONES SANITARIAS Y NUTRIMENTALES. METODOS DE PRUEBA
PREFACIO
En la revisión de la presente
Norma participaron los siguientes organismos e instituciones:
SECRETARIA DE SALUD
Comisión Federal para
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD PUBLICA
INSTITUTO NACIONAL DE CIENCIAS
MEDICAS Y DE NUTRICION SALVADOR ZUBIRAN
PRODUCTOS ALIMENTICIOS
DEUTSCHE QUIMICA, S.A. DE C.V.
MUHLENCHEMIE GMBH
UNILEVER DE MEXICO, S. DE R.L.
DE C.V.
COMPAñIA NESTLE, S.A. DE C.V.
KELLOGG COMPANY MEXICO, S. DE
R.L. DE C.V.
GRUPO ALTEX S.A. DE C.V.
GRUPO TRIMEX S.A. DE C.V.
MOLINO DE TRIGO EL PILAR, S.A.
DE C.V.
PROBST, S.A. DE C.V.
DSM NUTRITIONAL PRODUCTS MEXICO,
S.A. DE C.V.
CAMARA NACIONAL DE
GRUPO MAIZ INDUSTRIALIZADO,
S.A. DE C.V.
FABRICA DE HARINAS ELIZONDO,
S.A. DE C.V.
CAMARA NACIONAL DE
CAMARA NACIONAL DE MAIZ
INDUSTRIALIZADO
ASOCIACION MEXICANA DE
INDUSTRIALES DE GALLETAS Y PASTAS
KRAFT FOODS DE MEXICO, S. DE
R.L. DE C.V.
INDICE
1. OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACION
2. REFERENCIAS
3. DEFINICIONES
4. SIMBOLOS Y ABREVIATURAS
5. ESPECIFICACIONES SANITARIAS
5.1 GENERALES
5.2. ESPECIFICAS
5.2.1 TRANSPORTE Y Almacenamiento
de cereales destinados para consumo humano
5.2.2 HARINAS DE CEREALES, SEMOLAS O SEMOLINAS
5.2.3 Alimentos a base de
cereales, semillas comestibles, harinas, sEmolas o semolinas, o sus mezclas
5.2.4 Productos de
panificaciOn
6. MUESTREO
7. METODOS DE PRUEBA
8. ETIQUETADO
9. ENVASE Y EMBALAJE
10. CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES
11. BIBLIOGRAFIA
12. OBSERVANCIA DE
13. VIGENCIA
14. ANEXOS
APENDICES NORMATIVOS
Apéndice Normativo A: Aditivos para alimentos
Apéndice Normativo B: Muestreo de cereales
Apéndice Normativo C: Métodos de prueba
1.
Objetivo y campo de aplicación
1.1 Esta Norma Oficial Mexicana establece las
disposiciones y especificaciones sanitarias que deben cumplir el transporte y
almacenamiento de cereales destinados para consumo humano, así como el proceso
de las harinas de cereales, sémolas o semolinas, alimentos preparados a base de
cereales, de semillas comestibles, de harinas, de sémolas o semolinas o sus
mezclas y los productos de panificación.
1.2 No son objeto de esta norma, las botanas y
los alimentos a base de cereales para lactantes y niños de corta edad.
1.3 Esta Norma Oficial Mexicana establece los
nutrimentos que se deben adicionar y restituir en las harinas de trigo y de
maíz nixtamalizado y su nivel de adición, exceptuándose las utilizadas para:
frituras, como texturizantes o espesantes y base para harinas preparadas.
1.4 Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia
obligatoria en el Territorio Nacional para las personas físicas o morales que
se dedican al proceso o importación de los productos objeto de esta Norma
destinados a los consumidores en el Territorio Nacional.
2.
Referencias
Esta norma se complementa con las siguientes
normas oficiales mexicanas o las que la sustituyan:
● Modificación a
● NOM-086-SSA1-1994, Bienes y servicios. Alimentos y bebidas no alcohólicas con modificaciones en su composición. Especificaciones nutrimentales.
● NOM-120-SSA1-1994, Bienes y servicios. Prácticas de higiene y sanidad para el proceso de alimentos, bebidas no alcohólicas y alcohólicas.
● Modificación a
3.
Definiciones
Para fines de esta norma se entiende por:
3.1
Adicionar, añadir uno o más
nutrimentos, contenidos o no normalmente en el producto.
3.2
Aditivo, cualquier sustancia
que en cuanto tal no se consume normalmente como alimento, ni tampoco se usa
como ingrediente básico en alimentos, tenga o no valor nutritivo, y cuya
adición al alimento con fines tecnológicos (incluidos los organolépticos) en
sus fases de producción, elaboración, preparación, tratamiento, envasado,
empaquetado, transporte o almacenamiento, resulte o pueda preverse
razonablemente que resulte (directa o indirectamente) por sí o sus
subproductos, en un componente del alimento o un elemento que afecte a sus
características. Esta definición no incluye contaminantes o sustancias
añadidas al alimento para mantener o mejorar las cualidades nutricionales.
3.3
Aflatoxinas, a los
metabolitos secundarios producidos por hongos Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus y Aspergillus nomius,
que tienen efectos tóxicos y cancerígenos en animales, incluido el hombre.
3.4
Alimento, cualquier sustancia
o producto, sólido o semisólido, natural o transformado que proporciona al
organismo elementos para su nutrición.
3.5
Alimentos y bebidas no alcohólicas con modificaciones en su composición, a los productos a los que se les han
introducido cambios por adición, disminución o eliminación de uno o más de sus
nutrimentos, tales como hidratos de carbono, proteínas, lípidos, vitaminas y
minerales, y que forman parte de la dieta
habitual.
3.6
Alimentos preparados a base de: cereales, semillas comestibles, de harinas,
sémolas o semolinas o sus mezclas, a los productos alimenticios, elaborados a base de granos de cereales
u otros granos y semillas comestibles, enteros o sus partes o molidos (harinas,
sémolas o semolinas), preparados mediante procesos físicos, aptos para ser consumidos
directamente o previa cocción, adicionados o no de aditivos y de otros
ingredientes opcionales. Estos productos se pueden preparar por procesos tales
como: inflado, laminado, recubrimiento, tostado, extruido, aglomeración u
otros.
3.7
Azúcares, todos los
monosacáridos y disacáridos presentes en un alimento o bebida no alcohólica.
3.8
Biodisponibilidad, propiedad
de un nutrimento que indica la proporción de éste que es absorbida y utilizada por el organismo a partir de un
alimento cuantificada por métodos experimentales reconocidos.
3.9
Cereales, a los granos
comestibles de ciertas plantas pertenecientes a la familia de las gramíneas de
un solo cotiledón tales como: trigo, maíz, arroz, avena, centeno, cebada, sorgo
y amaranto, entre otros.
3.10 Coaduyante de elaboración, a la sustancia o materia, excluidos aparatos, utensilios y aditivos,
que no se consume como ingrediente alimenticio por sí misma, y se emplea
intencionalmente en la elaboración de materias primas, alimentos o sus
ingredientes, para lograr alguna finalidad tecnológica durante el tratamiento o
la elaboración, que puede dar lugar a la presencia no intencionada pero
inevitable, de residuos o derivados en el producto final.
3.11 Cobertura, al
ingrediente que se adiciona al producto de panificación de forma que lo cubra
total o parcialmente.
3.12 Consumidor, persona física o moral, que
adquiere o disfruta como destinatario final productos preenvasados. No es
consumidor quien adquiera, almacene o utilice alimentos y bebidas no
alcohólicas preenvasados, con objeto de integrarlos en proceso de producción,
transformación, comercialización o
prestación de servicios a terceros.
3.13 Dosis, al
contenido de un principio activo de cada componente en la fórmula de las
premezclas de micronutrimentos, independientemente del peso del compuesto
químico que lo contiene y que ha sido recomendado.
3.14 Embalaje,
material que envuelve, contiene y protege los productos preenvasados, para
efectos de su almacenamiento y transporte.
3.15 Envase o envase primario, cualquier recipiente o envoltura en el cual está contenido el producto
preenvasado para su venta al consumidor.
3.16 Envase colectivo o múltiple, cualquier recipiente o envoltura en el que se encuentran contenidos dos
o más unidades iguales o diferentes de productos preenvasados, destinados para
su venta al consumidor en dicha presentación.
3.17 Etiqueta,
cualquier rótulo, marbete, descripción, imagen u otra materia descriptiva o
gráfica, escrita, impresa, estarcida, marcada, grabada en alto o bajo relieve
adherida o sobrepuesta al envase del producto preenvasado o cuando no sea
posible por las características del producto, al embalaje.
3.18 Fecha de caducidad,
a la fecha límite en que se considera que un producto preenvasado almacenado en
las condiciones sugeridas por el fabricante, reduce o elimina las
características sanitarias que debe reunir para su consumo. Después de esta
fecha no debe comercializarse ni consumirse.
3.19 Fecha de consumo preferente, fecha en la que, almacenado bajo condiciones sugeridas por el
responsable del producto, expira el periodo durante el cual el producto
preenvasado es comercializable y mantiene las cualidades específicas se le
atribuyen tácita o explícitamente, pero después de la cual el producto
preenvasado puede ser consumido.
3.20 Galleta, al
producto elaborado fundamentalmente, por una mezcla de harina de trigo u otros
cereales, grasas, aceites comestibles o sus mezclas y agua, con o sin relleno,
adicionada o no de azúcares, de otros ingredientes opcionales y aditivos para
alimentos, sometida a proceso de amasado o batido, y otros procesos como
fermentación, modelado, troquelado y posterior tratamiento térmico, dando lugar
a un producto de presentación muy variada, caracterizado por su bajo contenido
en agua.
3.21 Grano entero, cereal
de granos intactos que al someterse a un proceso de molienda, rompimiento,
hojuelado entre otros conserva sus principales componentes anatómicos y están
presentes en una proporción relativamente igual a la existente en el grano
intacto original, logrando esto de manera natural o a través de medios
tecnológicos.
3.22 Harina o Harina de trigo, a la obtenida de la molienda del trigo del grano maduro, entero,
quebrado, y seco del género Triticum, L; de las especies T. vulgare, T. compactum
y T. durum o mezclas de éstas,
limpio, en el que se elimina gran parte del salvado y germen y el resto se
tritura hasta obtener un grano de finura adecuada.
3.23 Harina de arroz,
al producto resultante de la molienda del grano de arroz; maduro, limpio,
entero o quebrado y seco de la especie Oriza
sativa, L; blanco o ligeramente amarillento, el cual puede presentarse con
o sin pericarpio, sin glumas y pulido.
3.24 Harina de avena,
al producto resultante de la molienda del grano de avena; maduro, limpio,
entero y seco de la especie Avena sativa, L; y que además está
libre de sus envolturas celulósicas.
3.25 Harina de cebada,
al producto resultante de la molienda del grano de cebada; maduro, limpio,
entero y seco de la especie Hordeum
vulgare.
3.26 Harina de centeno,
al producto resultante de la molienda del grano de centeno; maduro, limpio,
entero y seco, de la especie Secale
cereale; sin envolturas celulósicas.
3.27 Harina de cereales,
al producto resultante de la mezcla de 2 o más, cereales o harinas de cereales.
3.28 Harina de grano entero, al producto obtenido de la
molienda del grano de cereal que conserva la cáscara y sus otros constituyentes
en una proporción relativa similar a la del grano intacto original, lográndose
esto ya sea de manera natural o por medios tecnológicos.
3.29 Harina de maíz,
al producto resultante de la molienda húmeda o seca de los granos de maíz;
maduro, limpio y seco del género Zea,
L; especies Z. mays y otras.
3.30 Harina de maíz nixtamalizado, al producto deshidratado
que se obtiene de la molienda de los granos del maíz nixtamalizado.
3.31 Harina integral,
al producto obtenido de la molienda del grano de cereal que conserva su cáscara
y sus otros constituyentes.
3.32 Información o etiquetado nutrimental, relación o enumeración del contenido de
nutrimentos de un alimento o bebida no alcohólica preenvasado. Comprende dos
aspectos:
a) Información nutrimental básica.
b) Información nutrimental complementaria.
3.33 Ingredientes opcionales, a los que se pueden adicionar al producto, tales como azúcares
naturales, mieles, frutas u otros productos comestibles, sus mezclas o
derivados.
3.34 Inocuo, lo que no
hace o causa daño a la salud.
3.35 Límite máximo, a
la cantidad establecida de aditivos, microorganismos, parásitos, materia
extraña, plaguicidas, radionúclidos, biotoxinas, residuos de medicamentos,
metales pesados y metaloides que no se deben exceder en un alimento, bebida o
materia prima.
3.36 Lote, a la
cantidad de un producto, elaborado
en un mismo ciclo, integrado por unidades homogéneas.
3.37 Maíz nixtamalizado o nixtamal, al maíz sano y limpio que ha sido sometido a cocción parcial con agua
en presencia de hidróxido de calcio (cal), u otro material alcalino.
3.38 Materia extraña,
al material orgánico o inorgánico, ligero o pesado, cuya presencia en el
producto no es deseable y que por arriba de un límite máximo se estima
contaminante, considerándose entre otros: excretas, pelos de cualquier especie,
fragmentos de insectos, material plástico y otros objetos.
3.39 Metal pesado o metaloide, a los elementos químicos que causan efectos indeseables en el
metabolismo aun en concentraciones bajas. Su toxicidad depende de las dosis en
que se ingieran así como de su acumulación en el organismo.
3.40 Métodos de prueba,
a los procedimientos analíticos utilizados en el laboratorio para comprobar que
un producto satisface las especificaciones que establece esta Norma.
3.41 Mezcla de Vitaminas y Minerales o premezclas, al conjunto de nutrimentos que se deben
adicionar, en los términos y cantidades especificados para cada caso.
3.42 Molienda o molturación, al mecanismo mediante el cual los granos de los cereales son triturados
y reducidos a partículas de diversos tamaños, separables entre sí por medios
mecánicos.
3.43 Muestra, al
número total de unidades de producto provenientes de un lote y que representan
las características y condiciones del mismo.
3.44 Nutrimento,
cualquier sustancia incluyendo a las proteínas, grasas o lípidos, carbohidratos
o hidratos de carbono, agua, vitaminas y minerales consumidos normalmente como
componente de un alimento o bebida no alcohólica que:
a) proporciona
energía; o
b) es necesario para
el crecimiento, el desarrollo y el mantenimiento de la vida; o
c) cuya carencia haga
que se produzcan cambios químicos o fisiológicos característicos.
3.45 Pan blanco, al
producto que resulta de hornear una masa obtenida de harina fermentada, agua y
sal, acondicionadores y mejoradores de masa, adicionado o no de aceites y
grasas comestibles, leche, otros ingredientes y aditivos para alimentos.
3.46 Pan de harina integral, al producto que resulta de la panificación de la masa fermentada,
preparada con mezclas de harina de trigo integrales, harinas de cereales
integrales o harina de leguminosas, agua, sal, azúcares, grasas comestibles,
otros ingredientes opcionales y aditivos para alimentos.
3.47 Pan dulce, al
producto que puede ser elaborado con harina, agua, huevo, azúcares, grasas o
aceites comestibles, levaduras, al que se le pueden o no incorporar aditivos
para alimentos, frutas en cualquiera de sus presentaciones, sal y leche;
amasado, fermentado, moldeado y cocido al horno o por fritura en grasas o
aceites comestibles.
3.48 Pasta, producto
obtenido por el amasado mecánico de sémola, semolina, harinas o cualquier
combinación de éstas procedentes de trigos con agua y otros ingredientes
opcionales permitidos, moldeado, laminado o extruido y sometido o no a un
proceso térmico de desecación.
3.49 Pastel o panqué,
al producto que se somete a batido y horneado, preparado con harinas de
cereales o leguminosas, azúcares, grasas o aceites, leudante y sal; adicionada
o no de huevo y leche, crema batida, frutas y otros ingredientes opcionales y
aditivos para alimentos.
3.50 Pay, al producto
elaborado con harina de cereales o galleta molida, azúcares, agua y sal, con o
sin leudante, grasas o aceites comestibles, fruta, crema pastelera,
ingredientes opcionales y aditivos para alimentos; moldeado en forma de corteza
para contener un relleno dulce o salado, puede ser cubierto horneado, frito o
congelado.
3.51 Plaguicidas, a
cualquier sustancia o mezcla de sustancias utilizadas para prevenir, destruir,
repeler o mitigar cualquier forma de vida que sea nociva para la salud, los
bienes del hombre o del ambiente, excepto la que exista sobre o dentro del ser
humano y los protozoarios, virus, bacterias, hongos y otros microorganismos
similares sobre o dentro de los animales.
3.52 Prácticas de Higiene, medidas necesarias para garantizar la inocuidad de los productos.
3.53 Proceso, al
conjunto de actividades relativas a la obtención, elaboración, fabricación,
preparación, conservación, mezclado, acondicionamiento, envasado, manipulación,
transporte, distribución, almacenamiento y expendio o suministro al público de
productos.
3.54 Producto a granel,
al producto que debe pesarse, medirse o contarse en presencia del consumidor
por no encontrarse preenvasado al momento de su venta.
3.55 Productos de bollería, a los que son cocidos por horneado de la masa fermentada preparada con
harina de trigo, u otros cereales, agua, sal, azúcares, grasas comestibles,
leudante, aditivos para alimentos e
ingredientes opcionales.
3.56 Productos de panificación, a los obtenidos de las mezclas de harinas de cereales o harinas
integrales o leguminosas, agua potable, fermentados o no, que pueden contener:
mantequilla, margarina, aceites comestibles, grasas vegetales, sal, leudantes,
polvo de hornear y otros aditivos para alimentos, especias y otros ingredientes
opcionales tales como, azúcares, mieles, frutas, jugos, granos y semillas
comestibles, entre otros; sometidos a proceso de horneado, cocción o fritura;
con o sin relleno o con cobertura, pueden ser mantenidos a temperatura
ambiente, en refrigeración o en congelación según el caso.
3.57 Producto preenvasado, los alimentos y bebidas no alcohólicas que cuando son colocados en un
envase de cualquier naturaleza en ausencia del consumidor y la cantidad de
producto contenida en él no puede ser alterada, al menos que el envase sea
abierto o modificado perceptiblemente.
3.58 Restitución se entiende la adición, a un alimento, de un
nutriente o nutrientes, que se hayan perdido en el curso de unas buenas prácticas
de fabricación o durante los procedimientos normales de almacenamiento y
manipulación, en cantidades tales que den lugar a la presencia en el alimento
de las concentraciones de nutriente o nutrientes presentes en la parte
comestible del alimento antes de su elaboración, almacenamiento o manipulación.
3.59 Refrigeración, al
método de conservación físico con el cual se mantiene el producto a una temperatura
máxima de 7°C (280 K).
3.60 Relleno, al
ingrediente agregado antes o después del horneado y que se encuentra en la
parte interna o entre dos o más unidades de los productos de panificación.
3.61 Sémolas o semolinas,
a las fracciones de granulometría diferentes a las de las harinas derivadas de
la molienda de cereales, libre de tegumentos y germen.
3.62 Semillas comestibles, a las que se consumen de forma directa o se utilizan en la elaboración
de otros productos, como: leguminosas, semillas de calabaza y girasol, entre
otras.
4. Símbolos y abreviaturas
Cuando en esta norma se haga
referencia a los siguientes símbolos y abreviaturas se entiende por:
AF aflatoxinas
Alc.Vol. alcohol volumen
As arsénico
BPF buenas prácticas de fabricación
CE coeficiente de extinción
Cd cadmio
cm centímetro
cSt centistoke
C.I. color index
e constante de
proporcionalidad
°C grado Celsius
IDR Ingesta Diaria Recomendada
K grado Kelvin
g gramo
h hora
= igual
Kcal kilocaloría
kg kilogramo
kJ kilojoule
L levógiro
LMR límite máximo residual
± más-menos
> mayor que
< menor que
< menor
o igual a
HPLC cromatografía líquida de alta resolución
mg microgramo
m metro
mg miligramo
ml mililitro
ml microlitro
mm micrómetro
mm milímetro
m/m masa masa
MM milimolar
min minuto
M molar
N normal
ng nanogramo
nm nanómetro
NMP número más probable
No número
Ø diámetro
p peso
Pb plomo
PBS solución amortiguadora de fosfatos
pH potencial de hidrógeno
p/p peso peso
p/v peso volumen
spp cualquier especie
ton toneladas
ton/min toneladas por minuto
v/v volumen volumen
X poder de resolución
/ por
x por
% por ciento
UFC unidades formadoras de colonias
v volumen
Cuando en la presente
norma se mencione a:
Acuerdo, debe
entenderse que se trata del Acuerdo por el que se determinan las sustancias
permitidas como aditivos y coadyuvantes en alimentos, bebidas y suplementos
alimenticios y sus modificaciones.
CICOPLAFEST, debe
entenderse que se trata de
Ley, debe entenderse
que se trata de
Reglamento, debe
entenderse que se trata del Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios.
Secretaría, debe
entenderse que se trata de
5. Especificaciones sanitarias
5.1 Generales.
Las materias primas que
se empleen para la elaboración de los productos objeto de esta norma, deben
cumplir con lo establecido en el Reglamento y las Normas Oficiales Mexicanas
correspondientes.
5.1.1 En el proceso de
los productos objeto de esta Norma, se deben aplicar las prácticas de higiene y sanidad establecidas en
5.1.2 El agua que se
utilice en el proceso deberá cumplir con el límite permisible de cloro residual
libre y de organismos coliformes totales y fecales establecidos en
5.1.3 Los productos
objeto de esta norma con modificaciones en su composición, deben sujetarse a lo
establecido en el Reglamento y en
5.1.4 El proveedor de
las materias primas, las unidades de transporte y los establecimientos en donde
se procesen o comercialicen los productos objeto de esta Norma, cada uno en el ámbito
de su responsabilidad, sólo podrán utilizar plaguicidas autorizados por
5.2 Específicas
5.2.1 Transporte y
almacenamiento de cereales destinados para consumo humano.
5.2.1.1 Las unidades
de transporte deben someterse a limpieza, hasta eliminar suciedad, residuos
vegetales, tierra, excretas, restos de animales, fauna nociva, telarañas,
productos químicos, sus envases, o cualquier producto o sustancia nociva para
el producto.
5.2.1.2 Cereales de
importación deben sujetarse a lo que se establece en
5.2.1.3 Las bodegas y
almacenamiento en intemperie deben dar aviso de funcionamiento conforme lo
indica el artículo 200 bis de
i) Establecer por
escrito, en su caso, los lugares en los que se almacenarán cereales que rebasen
el límite máximo de AF señalado en esta Norma.
ii) En el caso de los
almacenamientos en intemperie, deben contar con dispositivos que eviten el
contacto de los cereales con el suelo y contar con termopares. Los contenedores
no deben presentar filtraciones o
roturas.
iii) Las bodegas deben
ser edificios provistos de paredes, pisos y puertas, techados o que puedan ser
cubiertos, en los que no deben existir goteras, nidos, fisuras o puertas en mal
estado. Asimismo deben contar con termopares y estar colocados en diferentes
puntos del almacén para el monitoreo de la temperatura.
iv) Durante el
almacenamiento:
iv.1) No deben
almacenarse en la misma bodega cereales con concentraciones mayores de 20 mg/kg de
AF.
iv.2) Durante la recepción, el grano debe ser secado a
la brevedad hasta alcanzar una humedad menor o igual 14,5 %, misma que se debe conservar o disminuir
durante todo el tiempo que permanezca almacenado.
iv.3) Se permite la
aplicación a los cereales de fungistato, siempre y cuando se emplee de acuerdo
con las instrucciones del fabricante especificadas en la etiqueta.
iv.4) Los cereales no
podrán estar en contacto directo con el piso.
v) Contaminantes.
|
Determinación |
Límite máximo |
|
Aflatoxinas |
20 mg/kg |
vi) Para efectos de control, el almacenamiento
debe documentarse en bitácoras o registros de manera que garantice los
requisitos establecidos en
vi.1) Contar con respaldos que aseguren la veracidad de la información y un procedimiento para la prevención de acceso y correcciones no controladas.
vi.2) Conservarse por lo menos durante un año y estar a disposición de la autoridad sanitaria cuando así lo requiera.
vi.3) El diseño del formato queda bajo la responsabilidad del particular.
Tabla 1. Información mínima de
las bitácoras o registros
|
Registro de: |
Información |
|
Almacenamiento |
a) Lugares donde se almacenarán
los cereales que rebasen el límite máximo. b) Origen de los productos. c) Fechas de recepción y de
movilización de los productos. d) Localización de los puntos
de calentamiento (en su caso). |
|
Análisis del producto |
a) Físicos del grano: - Porcentaje de humedad. - Porcentaje de grano dañado. - Porcentaje de plagas. - Temperatura. - Resultados. - Fechas. b) Aflatoxinas: - Resultados. - Zonas muestreadas. - Fechas. - Método(s) utilizado(s). |
5.2.2 Harinas de cereales, sémolas o semolinas
Los cereales que se empleen como materia prima
en la elaboración de los productos objeto de este apartado deben ajustarse a la
siguiente disposición:
5.2.2.1 El productor de grano, el comercializador del
mismo y el industrial, cada uno en el ámbito de su responsabilidad deben
observar que los plaguicidas que se empleen en el tratamiento de granos y
semillas almacenados, en medios de transporte, en áreas de almacenamiento,
espacios vacíos y para el control de roedores, así como para la desinfestación
y protección de granos almacenados a granel o en costales, cumplan con los
límites de uso y no excedan los niveles máximos residuales establecidos en el
Catálogo de Plaguicidas de
5.2.2.2 Los productos objeto de este apartado, además
de sujetarse a lo establecido en el Reglamento deben cumplir con las siguientes
especificaciones:
5.2.2.3 Físicas
|
Determinación |
Límite máximo |
|
Humedad |
15% |
|
Materia extraña |
No más de 50 fragmentos de
insectos, no más de un pelo de roedor y estar exentos de excretas, en 50 g de
producto. |
5.2.2.4 Microbiológicas
|
|
Mesofílicos aerobios UFC/g |
Coliformes Totales UFC/g |
Hongos UFC/g |
|
Harina de trigo, sémolas o semolinas |
50,000 |
NA |
300 |
|
Harina
de maíz |
100,000 |
100 |
1000 |
|
Harina
de maíz nixtamalizada |
50,000 |
100 |
1000 |
|
Harina
de centeno |
100,000 |
100 |
200 |
|
Harina
de cebada |
100,000 |
100 |
200 |
|
Harina
de avena |
50,000 |
50 |
100 |
|
Harina
de arroz |
100,000 |
100 |
200 |
|
Harinas
integrales |
500,000 |
500 |
500 |
|
Harinas
integrales de trigo |
500,000 |
NA |
NA |
NA
= No Aplica
5.2.2.5 Contaminantes
|
Determinación |
Límite máximo µg / kg |
|
Aflatoxinas |
20 |
|
Aflatoxinas para harina de
maíz nixtamalizado |
12 |
5.2.2.6 Los productos objeto de este apartado deberán
someterse a análisis para las determinaciones de Pb y Cd periódicamente para
efectos de monitoreo. Los niveles de referencia (informativos) se establecen en
el siguiente cuadro.
|
Metales Pesados |
Límite máximo mg/kg |
|
Plomo (Pb) |
0,5 |
|
Cadmio (Cd) |
0,1 |
5.2.2.7 Especificaciones nutrimentales
i) Las harinas de trigo y de maíz nixtamalizado
deben ser restituidas con los siguientes nutrimentos y en los niveles que se
indican a continuación.
|
Nutrimento |
Nivel mínimo de adición mg/kg
de harina |
Fuente recomendada |
|
Tiamina (vitamina B1) |
5 |
Mononitrato de tiamina |
|
Riboflavina (vitamina B2) |
3 |
Riboflavina |
|
Niacina (vitamina B3) |
35 |
Nicotinamida |
ii) Las harinas de trigo y de maíz nixtamalizado
deben ser adicionadas con los siguientes nutrimentos y en los niveles que se
indican a continuación.
|
Nutrimento |
Nivel mínimo de adición mg/kg
de harina |
Fuente recomendada |
|
Acido fólico |
2 |
Acido fólico |
|
Hierro (como ión ferroso) |
40 |
Sulfato o fumarato ferroso |
|
Zinc |
40 |
Oxido de zinc |
ii.1)
Cuando se utilice sulfato
ferroso como fuente de hierro, el aporte debe ser de 31,61% como ión ferroso;
si se utiliza fumarato ferroso el aporte será de 31,4%
ii.2)
Cuando se utilice óxido de
zinc como fuente de zinc, el aporte del mismo corresponderá al 79,54%.
ii.3) Se podrán
utilizar otras fuentes de hierro y zinc, siempre que la cantidad biodisponible
sea, al menos, equivalente a la de las fuentes recomendadas.
iii) Quedan exentas de
la restitución y adición de micronutrimentos los siguientes productos:
iii.1) Harinas para
uso industrial distinto al consumo humano.
iii.2) Las sémolas y
semolinas para pastas, en las que la restitución y adición podrá hacerse en la
elaboración de la pasta, debiendo cumplir con los mismos niveles de adición;
excepto para zinc.
iv) Para efectos de
control, los establecimientos que procesan harinas de trigo y de maíz
nixtamalizado deberán contar con la siguiente información relativa a la restitución
y adición de nutrimentos:
iv.1) Procedimientos
escritos del proceso de restitución y adición y de los controles aplicados para
garantizar su eficiencia, incluidas las medidas correctivas que se aplicarán en
caso de desviaciones.
iv.2) Registro de las
variables críticas del proceso que demuestren que se cumplen los procedimientos
de restitución y adición, incluyendo reportes de las acciones correctivas
aplicadas cuando se detecten desviaciones o incumplimiento de las
especificaciones nutrimentales y resultados de análisis de producto terminado
(autocontroles).
v) Las premezclas de
nutrimentos deberán cumplir con lo siguiente:
v.1) La dosis deberá
ser suficiente para alcanzar el nivel mínimo de cada nutrimento para la
restitución y adición en mg/kg de
harina.
v.2) El envase debe de
garantizar la estabilidad e integridad de los nutrimentos, es necesaria la
protección a la luz, los materiales deben ser grado alimenticio.
v.3) Para estabilidad
y almacenamiento se deben seguir las indicaciones del fabricante, en la
especificación, hoja de seguridad y/o certificado de análisis.
vi) Deberá
contarse con la evidencia documental que garantice que las harinas que no han
sido restituidas y adicionadas serán destinadas para: frituras, como
texturizante o espesante o como base para harinas preparadas.
5.2.2.8
Aditivos para alimentos.
Sólo está permitido utilizar los aditivos señalados en el Apéndice
Normativo A.
5.2.3 Alimentos a base
de cereales, de semillas comestibles, harinas, sémolas o semolinas o sus
mezclas
Los productos objeto de este
apartado, deben cumplir con las siguientes especificaciones:
5.2.3.1
Microbiológicas.
|
Especificaciones |
Límite
máximo |
|
Mesofílicos
aerobios |
10 000 UFC/g |
|
Hongos |
300 UFC/g |
|
Coliformes
totales |
<30 UFC/g |
|
*Salmonella spp en 25 g |
negativa |
* Sólo para pastas con huevo
5.2.3.2 Deberán
someterse a análisis para las determinaciones de Pb y Cd, periódicamente para
efectos de monitoreo. Los niveles de referencia se establecen en el cuadro del
numeral 5.2.2.6.
5.2.3.3 Materia
extraña.
No más de 50 fragmentos de
insectos, no más de un pelo de roedor y estar exentos de excretas, en 50 g de
producto.
5.2.3.4
Aditivos para alimentos.
Solamente están permitidos los aditivos señalados en el Apéndice
Normativo A.
5.2.4 Productos de
panificación
5.2.4.1 Con el fin de
establecer las especificaciones sanitarias por sus características, los
productos objeto de este apartado se clasifican en:
Galletas.
Galletas con relleno o
cobertura o sus combinaciones.
Pan blanco.
Pan dulce.
Pan de harinas integrales.
Pastel y panqué.
Pays.
Productos de bollería.
5.2.4.2 Los productos
objeto de este apartado, además de cumplir con lo establecido en el Reglamento
deben ajustarse a las siguientes especificaciones:
i) Cuando se emplee
alcohol etílico como ingrediente, éste no debe exceder del 1,99% p/p
ii) Microbiológicas.
ii.1) Para el pan
blanco, pan de harinas integrales y productos de bollería:
|
Especificaciones |
Límite
máximo |
|
Mesofílicos
aerobios |
1000
UFC/g |
|
Coliformes
totales |
<10
UFC/g |
ii.2) Pan dulce:
|
Especificaciones |
Límite
máximo |
|
Mesofílicos
aerobios |
5000
UFC/g |
|
Coliformes
totales |
20 UFC/g |
|
Staphylococcus aureus * |
< 100
UFC/g |
* Debe determinarse únicamente
en el producto que contenga relleno o cobertura a base de huevo, leche, crema
pastelera u otro alimento preparado.
ii.3) Galletas:
|
Especificaciones |
Límite
máximo |
|
Mesofílicos
aerobios |
3000
UFC/g |
|
Coliformes
totales |
<10
UFC/g |
ii.4) Galletas con
relleno o cobertura o sus combinaciones:
|
Especificaciones |
Límite
máximo |
|
Mesofílicos
aerobios |
5000
UFC/g |
|
Coliformes
totales |
20 UFC/g |
ii.5) Pasteles,
panqués y pays:
|
Especificaciones |
Límite
máximo |
|
Mesofílicos
aerobios |
10000
UFC/g |
|
Coliformes
totales |
20 UFC/g |
|
Salmonella spp en 25 g |
Negativo |
|
Escherichia coli* |
Negativo |
|
Staphylococcus aureus ** |
100
UFC/g |
*Se determinará únicamente bajo
situaciones de emergencia sanitaria, cuando
** Esta especificación debe
determinarse únicamente en pasteles y pays, que contengan relleno o cobertura a
base de huevo, leche, crema pastelera u otro alimento preparado.
5.2.4.3 Materia
extraña.
No más de 50 fragmentos de
insectos, no más de un pelo de roedor y estar exentos de excretas, en 50 g de
producto.
5.2.4.4 Los productos
objeto de este apartado deberán someterse a análisis para las determinaciones
de Pb y Cd periódicamente para efectos de monitoreo. Los niveles de referencia
(informativos) se establecen en el cuadro del apartado 5.2.2.6.
5.2.4.5 Aditivos
para alimentos.
Solamente están permitidos los aditivos señalados en el Apéndice
Normativo A.
6. Muestreo
El procedimiento de muestreo
para los productos objeto de esta norma, debe sujetarse a lo que establece
6.1 El método para el
muestreo de los cereales para aflatoxinas, debe llevarse a cabo como se
establece en el Apéndice Normativo B.
7. Métodos de prueba
7.1 Para la
verificación de las especificaciones de los productos objeto de esta norma, se
deben aplicar los métodos de prueba señalados en el Apéndice Normativo C.
8. Etiquetado
Las etiquetas o envases
impresos de los productos preenvasados objeto de esta norma, además de cumplir
con lo establecido en el Reglamento, deben cumplir con lo siguiente:
8.1 Requisitos
Generales
8.1.1 Los productos
objeto de esta norma que hayan sido modificados en su composición, deben
sujetarse a lo establecido en el Reglamento y a
8.1.2 Los productos
destinados a ser comercializados en el mercado nacional, deben ostentar una
etiqueta con la información a que se refiere esta Norma en idioma español,
independientemente de que también pueda estar en otros idiomas, cuidando que
los caracteres sean al menos iguales en tamaño y proporcionalidad tipográfica y
de manera igualmente ostensibles.
8.1.3 La información
contenida en las etiquetas debe presentarse y describirse en forma clara, veraz
y comprobable.
8.1.4 Las etiquetas
que ostenten los productos preenvasados deben fijarse de manera tal que
permanezcan disponibles hasta el momento de su uso y consumo en condiciones
normales y deben aplicarse por cada unidad, envase múltiple o colectivo, con
caracteres claros, visibles, indelebles y en colores contrastantes, fáciles de
leer por el consumidor en circunstancias normales de compra y uso.
8.1.5 Debe aparecer en
la superficie principal de exhibición del envase del producto cuando menos, la
denominación del producto preenvasado. El resto de la información a que se
refiere esta Norma Oficial Mexicana puede incorporarse en cualquier otra parte
del envase del producto.
8.1.6 Para el caso de
envase múltiple o colectivo para su venta al consumidor, la información a que
se refiere esta Norma Oficial Mexicana debe figurar en dicho envase. Sin
embargo, la indicación del lote y la fecha de caducidad o de consumo preferente
deben aparecer en cada unidad y no tendrán que figurar en el envase múltiple o
colectivo. Además, en los productos se deberá indicar la leyenda "No
etiquetado para su venta individual" cuando los productos no declaren la
información a que se refiere esta Norma. Esta leyenda no será necesaria cuando
los envases individuales contenidos en un envase múltiple o colectivo, ostenten
la información a que se refiere esta Norma Oficial Mexicana.
8.1.7 Cuando el envase
múltiple o colectivo esté cubierto por una envoltura debe figurar en ésta toda
la información necesaria, excepto en los casos en que la etiqueta aplicada
pueda leerse fácilmente a través de la envoltura exterior.
8.1.8 Cuando en las etiquetas
se declaren u ostenten en forma escrita, gráfica o descriptiva que los
productos, su uso, aplicación, ingredientes o cualquier otra característica
están recomendados, respaldados o aceptados por centros de investigación,
asociaciones, organizaciones, entre otros. Se deberá contar con el sustento
técnico respectivo, el que estará a disposición de
8.2 Nombre o
denominación del producto preenvasado
8.2.1 El nombre o
denominación del producto preenvasado debe corresponder con la establecida en
los ordenamientos legales específicos, en ausencia de éstos, puede indicarse el
nombre de uso común, o bien, emplearse una descripción de acuerdo con las
características básicas de la composición y naturaleza del producto, que no
induzca a error o engaño al consumidor. En el caso de que haya sido objeto de
algún tipo de tratamiento se puede indicar el nombre de éste, con excepción de
aquellos que de acuerdo con los ordenamientos correspondientes sean de carácter
obligatorio.
8.3 Declaración de
ingredientes.
8.3.1 En la etiqueta de los productos preenvasados
cuya comercialización se haga en forma individual, debe figurar una lista de
ingredientes, la cual puede eximirse cuando se trate de productos de un solo
ingrediente.
8.3.2 La lista de ingredientes
debe ir encabezada o precedida por el término "ingredientes:"
8.3.3 Los ingredientes
deben enumerarse por orden cuantitativo decreciente (m/m).
8.3.4 Se debe declarar un ingrediente compuesto
cuando constituya más del 25 por ciento y debe ir acompañado de una lista entre
paréntesis de sus ingredientes constitutivos por orden cuantitativo decreciente
(m/m). Cuando constituya menos de ese porcentaje se deben declarar los aditivos
que desempeñan una función tecnológica en la elaboración del producto y
aquellos ingredientes o aditivos que se asocien a reacciones alérgicas, de
conformidad con los ordenamientos legales correspondientes.
8.3.5
Cuando se trate de alimentos
deshidratados o condensados, destinados a ser reconstituidos, pueden enumerarse
sus ingredientes por orden cuantitativo decreciente (m/m) en el producto
reconstituido, siempre que se incluya una indicación como la que sigue:
"ingredientes del producto cuando se prepara según las instrucciones de la
etiqueta" o similar.
8.3.6
En la lista de ingredientes
debe emplearse una denominación específica, excepto en las clases de
ingredientes señalados en el Anexo I donde puede emplearse una denominación
genérica.
8.3.7 No obstante lo estipulado en el punto
anterior, la manteca de cerdo y el sebo se deben declarar siempre por su
denominación específica.
8.3.8 Los aditivos empleados en la elaboración de
los productos objeto de esta Norma, deben reportarse con el nombre común o los
sinónimos establecidos en el Acuerdo y sus modificaciones, a excepción de los
saborizantes y las enzimas, los cuales pueden figurar con la denominación
genérica.
8.3.9 Debe ser incluido en la lista de ingredientes
todo aditivo que haya sido empleado en los ingredientes y que se transfiera a
otro producto en cantidad notable o suficiente para desempeñar en él una
función tecnológica.
8.3.10 Están exentos de su declaración en la lista
de ingredientes los aditivos transferidos a los productos preenvasados que ya
no cumplen una función tecnológica en el producto terminado, así como los
coadyuvantes de elaboración, excepto aquellos que puedan provocar reacciones
alérgicas y de intolerancia.
8.4. Nombre y domicilio fiscal.
8.4.1 Debe indicarse el nombre, la denominación o
razón social y el domicilio fiscal del responsable del producto, este último
debe incluir de manera enunciativa mas no limitativa: calle, número, código
postal, ciudad y estado.
8.4.2 Para productos importados preenvasados debe
indicarse en la etiqueta el nombre, denominación o razón social y domicilio
fiscal del importador. Esta información puede incorporarse al producto
preenvasado en territorio nacional, antes de la comercialización del producto.
Cuando en un establecimiento diferente al de
la persona física o moral, al licenciatario o causahabiente, propietario de la
marca, participe en el proceso de los productos, debe figurar en la etiqueta la
leyenda HECHO PARA... o alguna equivalente, seguido del nombre o domicilio
(calle, número, colonia, código postal, ciudad y estado) del responsable del
producto, asimismo el lote debe permitir la identificación del o los
establecimientos que intervienen en el proceso.
8.5 País de origen
Debe incorporarse la leyenda que identifique
el país de origen del producto, por ejemplo: Hecho en
., Producto de
,
Fabricado en
., o leyenda equivalente, seguida de país de origen.
8.6 Identificación de la clave del lote.
8.6.1 Cada envase debe llevar grabada o marcada de
cualquier modo, la identificación del lote al que pertenece, con una indicación
que pueda ser en clave que permita su rastreabilidad.
8.6.2 La identificación del lote que incorpore el
fabricante en el producto preenvasado no debe ser alterada u ocultada de forma
alguna.
8.6.3 Cuando se indique con el formato de fecha,
anteponerse la palabra Lote o su abreviatura L.
8.6.4 Si la identificación del lote corresponde a
la fecha de caducidad, anteponer las leyendas Lote y Fecha de caducidad o sus abreviaturas L y
Fech. Cad. o L y Cad.
8.7 Fecha de caducidad o de consumo preferente
8.7.1 Los productos objeto de esta norma deben
declarar la fecha de caducidad o la fecha de consumo preferente y cumplir con
lo siguiente:
i) El
fabricante debe declararla en el envase o etiqueta, la cual debe consistir por
lo menos de:
- El día y el mes para los productos de
duración máxima de tres meses;
- El mes y el año para productos de duración
superior a tres meses.
ii) La fecha debe estar precedida por una
leyenda que especifique que dicha fecha se refiere a la fecha de caducidad o al
consumo preferente.
-Para el caso de fecha de
caducidad, ésta debe indicarse anteponiendo alguna de las siguientes leyendas, sus
abreviaturas o leyendas análogas:
Fecha de caducidad ___,
Caducidad ____, Fech Cad ____,
-Para el caso de consumo
preferente, ésta debe indicarse anteponiendo alguna de las siguientes leyendas,
sus abreviaturas o leyendas análogas:
Consumir preferentemente antes
del____, Cons. Pref. antes del ___.
8.7.2 La fecha de
caducidad o de consumo preferente debe indicar en la etiqueta cualesquiera
condiciones especiales que se requieran para la conservación del alimento o
bebida no alcohólica preenvasado, si de su cumplimiento depende la validez de
la fecha. Por ejemplo, se pueden incluir leyendas como: "manténgase en
refrigeración"; "consérvese en congelación"; "una vez descongelado
no deberá volverse a congelar"; "una vez abierto, consérvese en
refrigeración", u otras análogas.
8.7.3 La fecha de
caducidad o de consumo preferente que incorpore el fabricante en el producto
preenvasado no puede ser alterada en ningún caso y bajo ninguna circunstancia.
8.8 Leyendas de
conservación
8.8.1 En las harinas
de cereales y en los productos elaborados a base de cereales, de semillas
comestibles, de harinas o sus mezclas y productos de panificación, debe figurar
la leyenda "Consérvese en lugar seco y fresco" o leyenda equivalente.
8.8.2 Para los
productos objeto de esta norma que requieren refrigeración o congelación deben
incluirse según corresponda, las leyendas: "Manténgase o consérvese en
refrigeración o congelación", o una leyenda equivalente.
8.9 Instrucciones de
uso
8.9.1 La etiqueta debe
contener las instrucciones de uso cuando sean necesarias sobre el modo de
empleo, incluida la reconstitución, si es el caso, para asegurar una correcta
utilización del producto preenvasado.
8.10 Etiquetado
Nutrimental
8.10.1 La declaración
nutrimental en la etiqueta de los productos objeto de esta norma es obligatoria
y debe incluir como mínimo lo siguiente:
a) Contenido energético
b) La cantidad de
proteínas,
c) La cantidad de
hidratos de carbono o carbohidratos disponibles, indicando la cantidad
correspondiente a azúcares
d) La cantidad de
grasas o lípidos, especificando la cantidad que corresponda a grasa saturada.
Los productos de panificación, además deben declarar el contenido de ácidos
grasos trans.
e) La cantidad de
fibra
f) La cantidad de
sodio
g) La cantidad del
nutrimento o los nutrimentos acerca de los cuales se hace una declaración de propiedades.
h) La cantidad de
cualquier otro nutrimento que se considere importante para mantener un buen
estado nutricional, según lo establezca
8.10.2 Cuando se haga
una declaración específica de propiedades referente a la cantidad o tipo de
hidrato de carbono o carbohidrato, podrán indicarse también las cantidades de
almidón y/u otros constituyentes de hidratos de carbono.
8.10.3 Cuando se haga
una declaración de propiedades con respecto a la cantidad o el tipo de ácidos
grasos o la cantidad de colesterol, deben declararse las cantidades de: ácidos
grasos monoinsaturados, ácidos grasos poliinsaturados y colesterol
8.11. Presentación de
la información nutrimental
8.11.1 La declaración
del contenido de nutrimentos debe hacerse en forma numérica.
8.11.2 La declaración
en forma numérica debe expresarse por 100 g o por 100 ml o por porción o por
envase, si éste contiene sólo una porción o se declara el número de porciones
que contiene el envase. Y debe expresarse en las siguientes unidades:
i. Contenido energético en kilojoules (kJ),
pudiendo además declararse en kilocalorías (kcal).
ii. Proteínas en gramos (g)
iii. Hidratos de carbono o carbohidratos disponibles en gramos (g), azúcares (g)
iv. Grasas o lípidos en gramos (g), ácidos
grasos saturados (g), ácidos grasos trans (g)
v. Fibra (g)
vi. Sodio en gramos (g) o miligramos (mg)
Adicionalmente, se pueden
emplear otras unidades de medidas.
8.11.3 La declaración
numérica sobre proteínas, vitaminas y minerales debe expresarse en unidades de
medida o en porcentaje de la ingestión diaria recomendada (IDR) por 100 g o por
100 ml o por porción o por envase, si éste contiene sólo una porción. En caso
de declararse en porcentaje de
Para estos casos, se debe
emplear la tabla de recomendaciones ponderadas para la población mexicana del
Anexo II de esta Norma.
8.11.4 La información
nutrimental puede presentarse conforme a lo indicado en el ejemplo de la
siguiente tabla. No es obligatorio que se presente de esta forma.
Presentación
de la información nutrimental
|
Presentación
de la información por 100 g, por 100 ml, por porción o por envase |
|
|
Contenido
energético |
_________
kJ (kcal) |
|
Proteínas |
_________
g |
|
Grasas |
_________
g, de los cuales _________ g de grasa saturada. |
|
Carbohidratos |
_________
g, de los cuales _________ g azúcares |
|
Fibra |
_________
g |
|
Sodio |
_________
g o mg |
|
Información
adicional |
_________
g, mg, mg o % IDR |
8.11.5 Los valores de
composición bromatológica que figuren en la información nutrimental del
producto, deben ser valores medios ponderados derivados por análisis, bases de
datos o tablas reconocidas internacionalmente.
8.11.6 Los valores de
los nutrimentos que figuren en la información pueden tener un grado de
variación, el cual debe garantizar al consumidor que los valores declarados en
la etiqueta correspondan a los contenidos en el producto hasta la fecha de
caducidad.
8.12 Cálculo de
nutrimentos
8.12.1 Energía, la
cantidad de energía declarada deberá calcularse utilizando los siguientes
factores de conversión:
Carbohidratos 4 kcal/g 17 kJ
Proteínas 4 kcal/g 17 kJ
Grasas 9 kcal/g 37
kJ
Alcohol 7 kcal/g 29
kJ
Acidos orgánicos 3 kcal/g 13 kJ
8.12.2 Proteínas, la
cantidad de proteínas a declarar deberá calcularse utilizando la siguiente
fórmula:
Proteína = contenido total de
nitrógeno Kjeldahl x 6.25
8.12.3 En los casos en
que se deba tomar en cuenta el contenido de polialcoholes o polidextrosas para
el cálculo de contenido energético se deben utilizar los siguientes factores de
conversión:
Polialcoholes
2,4 kcal/g 10 kJ
Polidextrosas 1 kcal/g 4 kJ
8.13. Información
nutrimental complementaria
8.13.1 El uso de
información nutrimental complementaria, escrita o gráfica, en las etiquetas de
los productos es opcional y en ningún caso debe sustituir la información
nutrimental.
8.13.2 Cuando se
presente la información nutrimental complementaria, deben aplicarse los
siguientes criterios:
8.13.3 La inclusión de
uno de los siguientes nutrimentos no obliga a incluir uno de los otros y sólo
se realiza si se tiene asignada una IDR y el contenido en la porción esté por
arriba del 5% de
Vitamina A (% IDR), Vitamina E
(% IDR), Vitamina C (% IDR), Vitamina B1 (Tiamina) (% IDR), Vitamina B2 (Riboflavina) (% IDR), Vitamina B6
(Piridoxina) (% IDR), Vitamina B12 (Cobalamina) (% IDR), Acido fólico (Folacina)
(% IDR), Niacina (Acido nicotínico) (% IDR), Calcio (% IDR), Fósforo (% IDR),
Magnesio (% IDR), Hierro (% IDR), Zinc (% IDR), Yodo (% IDR).
8.13.4 Todos o ninguno de los siguientes:
Grasa
poliinsaturada ___ g; grasa monoinsaturada __ g; ácidos grasos trans ___ g
colesterol ___ mg.
8.13.5 La inclusión de uno de los siguientes no
obliga a incluir a otros:
Almidones ___ g; fibras dietéticas __ g;
polialcoholes __ g; polidextrosas __ g.
8.13.6 Al expresar los tipos de constituyentes de
hidratos de carbono o carbohidratos y de lípidos o grasas referidos en el
numeral 8.10.1 incisos c) y d) se debe anteponer el texto "del
cual..."
8.13.7 Número de porciones por presentación.
8.13.8
La información nutrimental
complementaria puede presentarse conforme a la siguiente
Presentación de la declaración
nutrimental complementaria
|
Nutrimentos |
Porcentaje de IDR |
|
Vitamina
A |
% |
|
Vitamina
B1 (Tiamina) |
% |
|
Vitamina
B2 (Riboflavina) |
% |
|
Vitamina
B6 (Piridoxina) |
% |
|
Vitamina
B12 (Cobalamina) |
% |
|
Vitamina
C (Acido ascórbico) |
% |
|
Niacina
(Acido nicotínico) |
% |
|
Acido
fólico (Folacina) |
% |
|
Hierro |
% |
|
Potasio |
% |
8.13.9 La información
nutrimental complementaria en las etiquetas debe ir acompañada de programas
educativos al consumidor para aumentar su capacidad de comprensión, y lograr
que se haga uso de la información.
8.14 Requisitos
específicos
8.14.1 Las harinas de
trigo y de maíz nixtamalizado preenvasadas adicionadas con ácido fólico, hierro
y zinc y restituidas con vitamina B1, vitamina B2,
vitamina B3, deben cumplir con lo siguiente:
8.14.2 Sólo podrán
utilizar la siguiente denominación:
i) Harina de trigo adicionada con ácido fólico o
folacina o folato (vitamina Bc o vitamina B9)*, zinc y hierro,
restituida con Vitamina B1 (mononitrato de tiamina)*, Vitamina B2 (riboflavina)* y Vitamina B3
(niacina)*.
ii) Harina de maíz
nixtamalizado adicionada con ácido fólico o folacina o folato (vitamina Bc o
vitamina B9)*, hierro y zinc y restituida con Vitamina B1
(mononitrato de tiamina), Vitamina B2 (riboflavina)*, Vitamina B3
(niacina)*.
* Los términos entre paréntesis
serán opcionales.
8.14.3 No está
permitido emplear, denominación distinta a la establecida en esta norma. En los
productos preenvasados que las utilicen como materia prima podrán declararlas
en el listado de ingredientes como harina de trigo o harina de maíz
nixtamalizado.
8.14.4 En el caso de
las harinas de trigo y de maíz nixtamalizado preenvasadas se debe indicar el
contenido de ácido fólico, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B3, hierro y
zinc, en mg por 100 g del producto.
8.14.5 Las harinas de
trigo y de maíz nixtamalizado preenvasadas deberán declarar en la lista de
ingredientes las fuentes de hierro y cinc utilizados.
8.14.6 Cuando se
utilice el ácido ascórbico en la harina de trigo preenvasada se debe reportar
como aditivo y no como nutrimento.
8.14.7 Las harinas de maíz nixtamalizado deben
ostentar en la superficie principal de exhibición el proceso de nixtamalización
al que fue sometido. En el caso de que los productos hayan sido objeto de algún
otro tratamiento aplicado para asegurar su inocuidad se puede indicar el nombre
de éste con excepción de aquellos que de acuerdo con los ordenamientos
correspondientes sean de carácter obligatorio.
8.15 Leyendas precautorias
8.15.1 Los productos
que contengan alcohol etílico o bebidas alcohólicas en cantidades superiores al
0,5%, deben incluir en la superficie principal de exhibición de la etiqueta, la
siguiente leyenda: Este producto contiene ______% de alcohol. No recomendable
para niños. (En el espacio en blanco citar el contenido de alcohol en %).
8.15.2 Los productos
elaborados a base de cereales que contengan gluten; como trigo, avena, cebada y
centeno deben incluir la siguiente leyenda precautoria: este producto contiene
gluten, o algún otra equivalente. este producto contiene gluten u otra
equivalente o resaltándolo dentro de los listados de ingredientes (entre
paréntesis después de que aparezca el cereal fuente del mismo)
8.15.3 Se pueden
incluir leyendas informativas o de orientación que promuevan una dieta
saludable.
8.16 Declaraciones
prohibidas de propiedades
8.16.1 Se prohíbe el
uso de las siguientes declaraciones:
8.16.1.1 De
propiedades
i) Declaración de propiedades que hagan suponer que una alimentación equilibrada a base de alimentos ordinarios no puede suministrar cantidades suficientes de todos los elementos nutritivos.
ii) Declaraciones que no pueden comprobarse.
iii) Declaraciones de propiedades sobre la utilidad de un alimento o bebida no alcohólica para prevenir, aliviar, tratar o curar una enfermedad, trastorno o estado fisiológico.
iv) Declaraciones de propiedades que pueden suscitar dudas sobre la inocuidad de alimentos o bebidas no alcohólicas similares.
v) Declaraciones de propiedades que puedan causar o explotar el miedo al consumidor y utilizarlo con fines comerciales.
vi) Declaración de propiedades que afirmen que un determinado alimento constituye una fuente adecuada de todos los nutrientes esenciales
8.16.1.2 Que inducen a
error
i) Declaraciones de
propiedades sin significado, incluso los comparativos y superlativos.
ii) Declaraciones de
propiedades respecto a prácticas correctas de higiene o comercio, tales como:
"genuinidad", "salubridad", "sanidad", sano,
saludable, excepto las señaladas en otros ordenamientos legales aplicables.
iii) Declaraciones de
propiedades que afirmen la naturaleza u origen tales como: natural, puro,
fresco, fabricación casera, kosher, halal, orgánico" o
"biológico" de un alimento o bebida no alcohólica, excepto en
aquellos casos en que se compruebe que el producto tiene realmente esa
característica.
iv) Declaraciones de
propiedades que sugieran, impliquen o afirmen que el alimento está garantizado
o leyendas tales como calidad garantizada sello de garantía satisfacción
garantizada garantía de por vida garantía total 100% garantizado,
excepto en aquellos casos en que se informe a los consumidores en qué consisten
y la forma en que el consumidor puede hacerlas efectivas
8.17 Los productos
envasados en punto de venta, deben ostentar la siguiente información:
a) Nombre o denominación del producto
b) Declaración del contenido
c) Fecha de envasado y, en su caso, fecha de
caducidad o consumo preferente
9. Envase y embalaje
9.1 Envase
9.1.1 Los productos
preenvasados objeto de esta norma se deben envasar en recipientes elaborados
con materiales inocuos y resistentes a distintas etapas del proceso, de tal
manera que no reaccionen con el producto o alteren sus características físicas,
químicas, sensoriales y microbiológicas.
9.1.2 Para el caso de
los productos de panadería que se comercialicen a granel, el material que
proporcione el responsable del expendio para envolverlos o empacarlos, debe ser
limpio y nuevo, elaborado con materiales inocuos y resistentes, de tal manera
que no reaccionen con el producto o alteren sus características físicas,
químicas o sensoriales.
9.2 Embalaje
Se deben usar embalajes de
material resistente que ofrezcan la protección adecuada a los envases para
impedir su deterioro exterior, a la vez que faciliten su manipulación,
almacenamiento y distribución.
10 Concordancia con normas internacionales
Esta norma no es equivalente
con normas internacionales o normas mexicanas, excepto el apartado 5.2.2
referente a harinas de cereales, sémolas o semolinas en donde es parcialmente
equivalente a:
Norma Codex para la harina de
trigo. Codex Stan 152-1985 (Rev. 1-1995).
11 Bibliografía
11.1 Ley Federal sobre
Metrología y Normalización. Ultima reforma. México, D.F.
11.2 Ley General de
Salud. Ultima reforma. México, D.F.
11.3 Reglamento de
Control Sanitario de Productos y Servicios. México, D.F.
11.4 Secretaría de Comercio
y Fomento Industrial. 1981. NORMA-Z-13/02. Guía para la redacción,
estructuración y presentación de las Normas Oficiales Mexicanas. México, D.F.
11.5 Fernández, E. E.
1981. Microbiología sanitaria, agua y alimentos. Vol. 1. Universidad de
Guadalajara, México. pp. 685, 883, 839 y 840.
11.6 Frazier, W.C. y
Westhoff, D.C. 1985. Microbiología de los alimentos. 3a. edición. Editorial
Acribia, S.A. Zaragoza, España. pp. 379-380.
11.7 ICMSF. 1985.
Ecología microbiana de los alimentos. Volumen II. Editorial Acribia, S.A.
Zaragoza, España. pp. 812-828.
11.8 Libros de
consulta sobre tecnología de alimentos. Procesamiento de cereales. UNIFEM 1994.
pp. 1-18
11.9 Catalán C. M.
Tecnología de los cereales. Ed. Acribia. Zaragoza España 1971
11.10 Codex Alimentarius. Cereales, legumbres, leguminosas, productos
derivados y proteínas vegetales. Vol. 7. Segunda edición 1985.
11.11 Macoco P. M. C.
Contenido de micotoxinas en cereales para alimento de animales. 1994. UNAM.
Facultad de Ciencias.
11.12 Derache R.
Toxicología y seguridad de los alimentos. Ediciones Omega, S.A. Barcelona 1990.
11.13 Comisión del Codex Alimentarius. Informe de la 36a. reunión
del comité del CODEX sobre aditivos alimentarios y contaminantes en los
alimentos.
11.14 Serna S. S.
Química, Almacenamiento e industrialización de los cereales. AGT Editor, S.A.
1996
11.15 INCMSZ. Tablas
de Valor nutritivo de los alimentos de mayor consumo en Latinoamérica 1996
11.16 Compuestos de
Hierro para
11.17 Llanos M.
D. Economic Analysis June 2004 Of a National Folic Acid Fortification. Program
in Chile Associate Researcher Institute of Nutrition and Food Technology (INTA)
Universidad de Chile (Octubre 2003)
11.18 Lindsay H.
A. Ph. D. Folate and vitamin B12 status in the
11.19 Whittaker
Paul. Iron and zinc interactions in humans. American Society For Clinical
Nutritional. 1998; 68 (Suppl) 442S- 446S
11.20 Pan
American Health Organization. Flour Fortification With Iron, Folic Acid And
Vitamin B12 Regional Meeting Report October 9-10, 2003
11.21 Organización
Panamericana de
11.22 Food and
Drug Administration. 1989. Code of Federal Regulations. 21. PARTS 100 to 169
Revised as of Abril 1. p. 252-265.
11.23 Codex
Committee on Food Additives. 19th Session The Hague, 5-11 November 1985.
Information on Legal and Other Administrative Limits for Contaminants in Food. Annex 1 to CX/Fa 85/18. p. 24, 70, 81, 87, 89.
11.24 Comisión del Codex Alimentarius. 26 al 30 de Octubre
de 1992. Informe de la 8a. reunión sobre Cereales, Legumbres y Leguminosas,
Washington, D.C. p. 3.
11.25 Comité del Codex sobre Aditivos Alimentarios y
Contaminantes de los Alimentos. 22a. Reunión
11.26 Egmond Van
H.P. National Institute of Public Health and Environmental Hygiene. 28
September to 3 October 1987. The
Neatherland. MYC 81/9.2. p. 25-28.
11.27 FAO, OMS, OPS.
1992. Conferencia Internacional Sobre Nutrición. Informe de México. Comisión Nacional de Alimentos. México, 7a.
Reunión, Washington, D.C. 22-26 de octubre de 1990 CX/CPL 90/8-Add. 1 Mayo 1990. p. 18, 19, 22,
23.
11.28 Minister of
Supply and Services
11.29 Reglamentaciones
Técnico-Sanitarias del Sector Alimentario. 1989. Tomo II. 1a. ed. Edit. A.
Madrid Vicente. Madrid, España. p. 283-293, 304, 310, 346 y 352.
11.30 Andrew E. Czeizel, et-al. 1992. Prevention of
the first occurence of neural-tube defects by periconceptional vitamin
supplementation. The
11.31
11.32 Brody Tom,
et-al. 1984. Folic Acid. Handbook of vitamins. De. Laurence J. Machlin, Marcel
Decker, Inc. p. 459-496.
11.33 Fondu M.
1980. Food Additives Tables. Ed. Elsevier Scientific Publishing Company
11.34 Jelinek Charles
F. 1987. Distribución de Micotoxinas: Análisis de los datos mundiales sobre
productos básicos, incluidos los datos del programa conjunto internacional
FAO/OMS/PNUM sobre vigilancia de la contaminación de los alimentos. Tema 5.
FAO, OMS, UNEP, JOIN FAO/WHO/UNEP, Second International Conference on Micotoxin
Bangkok Tailand. Currents Limits and Regulation on Micotoxins. p. 11-15.
11.35
11.36 Kumate Rodríguez,
J. et-al. 1992. Manual para la vigilancia epidemiológica. Defectos del tubo
neural. No. 16. Secretaría de Salud.
11.37 Pérez Escamilla
Rafael. 1995. Folic acid fortification for the prevention of neural tube
defects: consensus needed on potential adverse effects. American Journal of
Public Health, Vol. 85. No. 11.
11.38 Pomeranz
Y. 1989. Wheat: Chemistry and Technology; Vol. II. Edited by The American
Association of Cereal Chemists, Inc. Minessota
11.39 Programa de las
Naciones Unidas para el Medio Ambiente y de
11.40 Programa
Universitario de Investigación en Salud. 1996. Universidad Nacional Autónoma de
México. Coordinación para
11.41 Quaglia G. 1991.
Ciencia y Tecnología de
11.42 Reilly Conor.
1991. Metal Contamination of Food. 2a. Edición. Edit.
Elsevier Applied Science. UK. p.
116, 137 y 154-155.
11.43 Ruiz-Matus,
Cuauhtémoc, et-al. Panorama epidemiológico de los defectos del tubo neural en
México. Gac. Méd. Mex. Vol. 131, No. 4, p. 485-489.
11.44 Spivey Fox
M.R. 1976. Cadmium Metabolism-A, Review of Aspects Pertinent to Evaluating
Dietary Cadmiun Intake by Man, The Nutrition Fundation a Monograph. Edited by Prasad A, S. Cap. 42. p. 403-408.
11.45 Hongos productores
de micotoxinas emergentes. Lourdes Abacarca, Bragulat, castellá, Accensi y
Cabañes. Revista Iberoamericana de Micología 2000; 17:S63-S68.
11.46 Contaminación
natural con micotoxinas en maíz forrajero y granos de café verde en el Estado
de Nayarit (México). Lourdes Robledo, Marín y Ramos. Revista Iberoamericana de
Micología 2001:18:141-144.
11.47 Código de
prácticas para reducir la aflatoxina B1 presente en las materias primas y los
piensos suplementarios para animales productores de leche. CAC/RCP 45-1997. Codex Alimentarius.
11.48 Código de
prácticas para prevenir y reducir la contaminación de los cereales por
micotoxinas, con anexos sobre
11.49 Estudio FAO:
Alimentación y nutrición Reglamentos a nivel mundial para las micotoxinas en a
los alimentos y en las raciones en el año 2003. Organización de las Naciones
Unidas para
11.50 Manual sobre la
aplicación del sistema de análisis de peligros y de puntos críticos de control
en la prevención y control de las micotoxinas, Organización de las Naciones
Unidas para
11.51 Principios
generales para la adición de nutrientes esenciales a los alimentos CAC/GL
09-1987 (Enmendados en 1989, 1991) Codex
Alimentarius
12 Observancia de la norma
12.1 La vigilancia de la aplicación de esta norma
corresponde a
13 Vigencia
13.1 La presente Norma
Oficial Mexicana entrará en vigor a los ciento ochenta días naturales contados
a partir de la fecha de su publicación en el Diario Oficial de
13.2 A su entrada en
vigor, la presente norma oficial mexicana cancela las Normas Oficiales
Mexicanas:
NOM-147-SSA1-1996. Bienes y
servicios. Cereales y sus productos. Harinas de cereales, sémolas o semolinas.
Alimentos a base de cereales, de semillas comestibles, harinas, sémolas o
semolinas o sus mezclas. Productos de panificación. Disposiciones y
especificaciones sanitarias y nutrimentales, y
Sufragio Efectivo. No
Reelección.
Atentamente
México, D.F., a 10 de marzo de
2009.- El Comisionado Federal para
14. Anexos
Anexo I
|
Clases
de ingredientes |
Denominación
genérica |
|
Aceites
refinados distintos del aceite de oliva |
"Aceite",
juntamente con el término "vegetal" o "animal",
calificado con el término hidrogenado, según el caso. |
|
Grasas
refinadas |
"Grasas",
juntamente con el término "vegetal" o "animal", según el
caso. |
|
Almidones,
distintos a los almidones modificados químicamente. |
"Almidón".
|
|
Todos
los tipos de carne de pescado, cuando el pescado constituya un ingrediente de
otro alimento y siempre que en la etiqueta y presentación de dicho alimento
no se haga referencia a una determinada especie de pescado. |
"Pescado".
|
|
Todos
los tipos de carne de aves de corral, cuando dicha carne constituya un
ingrediente de otro alimento y siempre que en la etiqueta y la presentación
de dicho alimento no se haga referencia a un tipo específico de carne de aves
de corral. |
"Carne
de ave". |
|
Todos
los tipos de quesos, cuando el queso o una mezcla de quesos constituya un
ingrediente de otro alimento y siempre que en la etiqueta y la presentación
de dicho alimento no se haga referencia a un tipo específico de queso. |
"Queso".
|
|
Todas
las especias y extractos de especias en cantidad no superior al 2% en peso,
solos o mezclados en el alimento. |
"Especia",
"especias" o "mezclas de especias", según el caso. |
|
Todas
las hierbas aromáticas o partes de hierbas aromáticas en cantidad no superior
al 2% en peso, solas o mezcladas en el alimento. |
"Hierbas
aromáticas" o "mezclas de hierbas aromáticas", según el caso. |
|
Todos
los tipos de preparados de goma utilizados en la fabricación de la goma de
base para la goma de mascar. |
"Goma
de base". |
|
Todos
los mono y disacáridos. |
"Azúcares".
|
|
La
dextrosa anhidra y la dextrosa monohidratada. |
"Dextrosa"
o "glucosa". |
|
Todos
los tipos de caseinatos. |
"Caseinatos".
|
|
Manteca
de cacao obtenida por presión o extracción o refinada. |
"Manteca
de cacao". |
|
Todas
las frutas confitadas, sin exceder del 10% del peso del alimento. |
"Frutas
confitadas". |
|
Todos
los condimentos en cantidad no superior al 2% en peso, solos o mezclados en
el alimento. |
"Condimentos".
|
Anexo
II
Ingestión
Diaria Recomendada (IDR) ponderada para la población mexicana
|
Nutrimento |
IDR |
|
|
Proteínas |
73,0 |
g |
|
Vitamina A |
570,0 |
µg Eq
retinol |
|
Vitamina E |
11,0 |
mg Eq
tocoferol |
|
Vitamina B1 (Tiamina) |
800,0 |
µg |
|
Vitamina B2
(Riboflavina) |
840,0 |
µg |
|
Vitamina B6
(Piridoxina) |
930,0 |
µg |
|
Niacina |
11,0 |
mg Eq
niacina |
|
Ac. Fólico |
390,0 |
µg |
|
Vitamina B12
(cobalamina) |
2,1 |
µg |
|
Vitamina C (Ac. Ascórbico) |
60,0 |
mg |
|
Calcio |
900,0 |
mg |
|
Cobre |
650,0 |
µg |
|
Flúor |
2,2 |
mg |
|
Fósforo |
664,0 |
mg |
|
Hierro |
17,0 |
mg |
|
Magnesio |
250,0 |
mg |
|
Zinc |
10,0 |
mg |
APENDICE NORMATIVO A
ADITIVOS PARA ALIMENTOS
1 Harinas de cereales, sémolas o semolinas
1.1 En la elaboración de las harinas de cereales, sémolas o semolinas se permite el empleo de los siguientes aditivos y coadyuvantes:
|
Aditivo |
Límite máximo mg/kg de harina |
|
Acido L- ascórbico y su sal
de sodio* |
BPF |
|
Azodicarbonamida |
45, en harina para pan leudado |
|
Cloro |
2,500 ** |
|
Cloruro de amonio |
BPF |
|
Dióxido de azufre |
200, en harina para bizcochos y fabricación de pastas solamente |
|
Dióxido de cloro |
2,500 ** |
|
Fosfato monocálcico |
2500 |
|
Lecitina |
200 |
|
Peróxido de benzoilo |
75 |
|
Peróxido de calcio |
50 |
|
Sulfato cálcico |
BPF |
* Uso exclusivo como aditivo, no como
nutrimento.
** Dosis de tratamiento
1.2 Enzimas, en la
elaboración de los productos objeto de este apartado se pueden emplear
únicamente las enzimas listadas en el Acuerdo y sus modificaciones, derivadas
de las fuentes que ahí se establecen y conforme a las BPF.
2 Alimentos a base de cereales, de semillas comestibles, harinas,
sémolas o semolinas o sus mezclas
En la elaboración de los
alimentos a base de cereales, de semillas comestibles, harinas, sémolas o
semolinas o sus mezclas, se permite el empleo de los siguientes aditivos y
coadyuvantes
2.1 Acentuadores de
sabor
|
Aditivos |
Límite máximo mg/kg de
producto |
|
5´´ guanilato de calcio |
BPF |
|
5´´ guanilato dipotásico |
BPF |
|
5´´ guanilato disódico |
BPF |
|
5´´ inosinato de calcio |
BPF |
|
5´´ inosinato de potasio |
BPF |
|
5´´ inosinato disódico |
BPF |
|
Acido 5´ guanílico |
BPF |
|
Acido L glutámico |
BPF |
|
Acido inosínico |
BPF |
|
Cloruro de sodio |
BPF |
|
Dextrinas |
BPF |
|
Glutamato monosódico |
BPF |
|
Glutamato de calcio |
BPF |
|
Glutamato de magnesio |
BPF |
|
Glutamato monoamónico |
BPF |
|
Glutamato monopotásico |
BPF |
2.2 Antioxidantes
|
Aditivos |
Límite máximo mg/kg |
|
Acido isoascórbico |
BPF |
|
Acido L-ascórbico |
BPF |
|
Acido
palmitil-6-L-ascórbico (palmitato de ascorbilo) |
200 de grasa* |
|
Alfa tocoferol |
85 |
|
Ascorbato de potasio |
BPF |
|
Butilhidroquinona terciaria (TBHQ) |
200 de grasa |
|
Butilhidroxianisol (BHA) |
50 |
|
Butilhidroxitolueno (BHT) |
50 |
|
Galato de propilo |
100 |
|
Gluconato de potasio |
BPF |
|
Isoascorbato de sodio |
BPF |
|
L-ascorbato cálcico |
BPF |
|
L-ascorbato sódico |
BPF |
|
Tocoferoles mezclados |
BPF |
*La
cantidad máxima de uso como antioxidante, será independiente de la cantidad
utilizada como nutrimento.
2.3 Colorantes
|
Aditivos |
Límite máximo mg/kg de producto |
|
Amarillo 2G Amarillo alimentos 5 No. C.I. 18965 |
100 * |
|
Amarillo ocaso FCF Amarillo alimentos 3 No. C.I. 15985 |
300 * |
|
Amarillo alimentos 4 Tartrazina No. C.I. 19140 |
100 * |
|
Antocianinas |
BPF |
|
Azorrubina y sus lacas Rojo alimentos 3 y sus lacas Carmoisina No. C.I. 14720 |
200 |
|
Azul brillante FCF Azul alimentos 2 y sus lacas No. C.I. 42090 |
100 |
|
Beta-apo 8carotenal Anaranjado alimentos 6 No. C.I. 40820 |
30 |
|
Beta
caroteno Anaranjado
alimentos 5 No. C.I.
40800 |
BPF |
|
Cantaxantina Anaranjado alimentos 8 No. C.I. 40850 |
BPF |
|
Caramelo Clases I, II y III |
BPF |
|
Caramelo clase IV |
2500 |
|
Carotenos naturales Anaranjado alimentos 5 No. C.I. 75130 |
4001 1,0002 |
|
Clorofilas Verde natural 3 No C.I.75810 |
BPF |
|
Clorofilina |
BPF |
|
Cúrcumina No. C.I. 75300 |
BPF |
|
Dióxido de titanio Pigmento blanco 6 No. C.I. 77891 |
10 000 |
|
Eritrosina Rojo alimentos 14 No. C.I. 45430 |
100 * |
|
Extracto de annato (Extracto de semillas de Bixa orellana). Anaranjado natural 4 No. C.I. 75120 |
25 |
|
Extracto de cochinilla Rojo natural 4 Carmín No. C.I. 75470 |
1503 |
|
Indigotina Azul alimentos 1 No. C.I. 73015 |
300 |
|
Oleorresina de paprika o extracto de paprika |
BPF |
|
Ponceau 4R Rojo alimentos 7 Rojo 6 |
200 |
|
Riboflavina |
3004 |
|
Rojo allura AC Rojo alimentos 17 No. C.I. 16035 |
500 * |
|
Rojo betabel o rojo
remolacha |
BPF |
|
Verde rápido F.C.F Verde alimentos 3 No. C.I. 42053 |
500 * |
Se pueden utilizar las lacas de
aluminio de los colorantes sintéticos antes mencionados, en una concentración
de uso que no exceda la concentración permitida del colorante del que proceda.
* La suma de estos colorantes
artificiales no debe exceder de 500 mg/kg de producto.
1 Sólo para cereales para el desayuno
2 Mezclas para rebozar
3 Postres a base de cereales y almidón
4 Cereales par desayuno, pasta y fideos,
mezclas para rebozar y postres
2.4 Estabilizantes
|
Aditivos |
Límite máximo g/kg de harina |
|
Acido algínico |
BPF |
|
Agar-agar |
BPF |
|
Alfa ciclodextrina |
BPF |
|
Alginato de amonio |
BPF |
|
Alginato de calcio |
BPF |
|
Alginato de potasio |
BPF |
|
Alginato de sodio |
BPF |
|
Almidón modificado |
BPF |
|
Carboximetilcelulosa |
BPF |
|
Carboximetilcelulosa de sodio |
BPF |
|
Carragenato de amonio,
potasio y sodio (incluido el furcelaran) |
BPF |
|
Carragenina |
BPF |
|
Celulosa microcristalina |
BPF |
|
Cloruro de calcio |
BPF |
|
Cloruro de magnesio |
BPF |
|
Cloruro de potasio |
BPF |
|
Dextrinas |
BPF |
|
Estearoil 2- lactilato de sodio o calcio |
5,000 |
|
Esteres acéticos de los mono
y diglicéridos de los ácidos grasos |
BPF |
|
Esteres cítricos de los mono
y diglicéridos de los ácidos grasos |
BPF |
|
Esteres de ácido diacetil tartárico |
BPF |
|
Esteres de poliglicerol de
ácidos grasos |
10 Solo o combinado con otro éster |
|
Esteres de propilenglicol de
ácidos grasos |
3,750 |
|
Esteres del ácido láctico de
ácidos grasos |
BPF |
|
Gamma ciclodextrina |
BPF |
|
Gluconato de sodio |
BPF |
|
Goma de semillas de algarrobo |
BPF |
|
Goma arábiga |
BPF |
|
Goma gellana |
BPF |
|
Goma guar |
BPF |
|
Goma karaya |
BPF |
|
Goma tara |
BPF |
|
Goma tragacanto |
BPF |
|
Goma xantano |
BPF |
|
Grenetina |
BPF |
|
Hidroxipropilcelulosa |
BPF |
|
Hidroxipropilmetilcelulosa |
BPF |
|
Lactitol |
BPF |
|
Lecitina |
BPF |
|
Maltodextrina |
BPF |
|
Metil celulosa |
BPF |
|
Mono y diglicéridos de los
ácidos grasos |
BPF |
|
Monoestearato de glicerilo |
BPF |
|
Monoestearato de sorbitán |
6,100 |
|
Monoglicéridos acetilados |
BPF |
|
Pectina |
BPF |
|
Polidextrosas A y N |
PBF |
|
Polivinil pirrolidona |
BPF |
|
Sal de ácido oléico con
calcio, potasio y sodio |
BPF |
|
Sal mirística, palmítica y
ácidos esteáricos con amonio, calcio, potasio y sodio |
BPF |
|
Triestearato de sorbitán |
10,000 |
2.5 Humectantes
|
Aditivos |
Límite
máximo g/kg de producto |
|
Glicerina |
BPF |
|
Sorbitol |
120 * |
|
Triacetina
|
BPF |
* Su
uso está limitado a dicha concentración tanto como humectante como edulcorante.
2.6 Reguladores de pH
|
Aditivos |
Límite
máximo g/kg de producto |
|
Acetato de amonio |
BPF |
|
Acetato de calcio |
BPF |
|
Acetato de potasio |
BPF |
|
Acetato de sodio |
0,07 |
|
Acido acético glacial |
BPF |
|
Acido cítrico |
BPF |
|
Acido clorhídrico |
BPF |
|
Acido fumárico |
BPF |
|
Acido láctico |
BPF |
|
Acido málico |
BPF |
|
Carbonato ácido de sodio |
BPF |
|
Carbonato ácido de amonio |
BPF |
|
Carbonato
ácido de potasio |
BPF |
|
Carbonato amónico |
BPF |
|
Carbonato cálcico |
BPF |
|
Carbonato magnésico |
BPF |
|
Carbonato potásico |
BPF |
|
Carbonato sódico |
BPF |
|
Citrato trisódico |
BPF |
|
Citrato dipotásico |
BPF |
|
Citrato triamónico |
BPF |
|
Citrato tricálcico |
BPF |
|
Citrato tripotásico |
BPF |
|
D-L-ácido tartárico |
BPF |
|
Dióxido de carbono |
BPF |
|
Fosfato de calcio dibásico |
5 * |
|
Fosfato de calcio monobásico |
5 * |
|
Fosfato de calcio tribásico |
5 * |
|
Fosfato de sodio dibásico |
5 |
|
Fosfato de sodio tribásico |
5 |
|
Fumarato de sodio |
BPF |
|
Gluconato de calcio |
BPF |
|
Gluconato de magnesio |
BPF |
|
Glucono delta lactona |
BPF |
|
Hidrogenomalato de potasio |
BPF |
|
Hidrogenomalato de sodio |
BPF |
|
Hidróxido de calcio |
BPF |
|
Hidróxido de amonio |
BPF |
|
Hidróxido de magnesio |
BPF |
|
Hidróxido potásico |
BPF |
|
Hidróxido sódico |
BPF |
|
Lactato de amonio |
BPF |
|
Lactato de calcio |
BPF |
|
Lactato de magnesio |
BPF |
|
Lactato de potasio |
BPF |
|
Lactato de sodio |
BPF |
|
Malato de calcio |
BPF |
|
Malato de potasio |
BPF |
|
Malato de sodio |
BPF |
|
Oxido de calcio |
BPF |
|
Pirofosfato de calcio |
5 * |
|
Sulfato de potasio |
BPF |
|
Sulfato de sodio |
BPF |
*La
cantidad máxima de uso como regulador(es) de acidez, será independiente de la
cantidad utilizada como aporte de calcio.
2.7 Conservadores
|
Aditivos |
Límite
máximo g/kg de producto |
|
Acido
propiónico |
BPF |
|
Propionato
de calcio |
BPF |
|
Propionato
de potasio |
BPF |
|
Propionato
de sodio |
BPF |
2.8 Antiaglutinantes
|
Aditivos |
Límite
máximo g/kg de producto |
|
Dióxido
de silicio amorfo |
BPF |
|
Etilcelulosa |
BPF |
|
Oxido de
magnesio |
BPF |
|
Silicato
de calcio |
BPF |
|
Silicato
de aluminio |
BPF |
|
Silicato
de aluminio y calcio |
BPF |
|
Silicato
de magnesio |
BPF |
|
Silicato
de sodio y aluminio |
BPF |
|
Talco |
BPF |
2.9 Gas de envasado
|
Aditivos |
Límite
máximo mg/kg de producto |
|
Nitrógeno
|
BPF |
|
Oxido
nitroso |
BPF |
|
Propano |
BPF |
2.10 Secuestrantes
|
Aditivos |
Límite
máximo mg/kg de producto |
|
Glutamato
de potasio |
BPF |
|
Glutamato
de sodio |
BPF |
2.11 Saborizantes y
aromatizantes
En la elaboración de los
productos objeto de este apartado, se permite el empleo de los saborizantes o aromatizantes establecidos en el Acuerdo.
3. Productos de panificación
En la elaboración de los
productos objeto de este apartado, se permite el empleo de los aditivos y coadyuvantes siguientes:
3.1 Acentuadores de
sabor
|
Aditivos |
Límite
máximo mg/kg de producto |
|
Acido
glutámico |
BPF |
|
Cloruro
de potasio |
BPF |
|
Cloruro
de sodio |
BPF |
|
Etilmaltol |
100 |
|
Extracto de levadura de Sacharomyces cerevisae |
BPF |
|
Glutamato
de calcio |
BPF |
|
Glutamato
de magnesio |
BPF |
|
Glutamato
monoamónico |
BPF |
|
Glutamato
monopotásico |
BPF |
|
Glutamato
monosódico |
BPF |
|
Guanilato
disódico |
BPF |
|
Inosinato
disódico |
BPF |
|
Maltodextrinas
|
BPF |
|
Sacarosa |
BPF |
3.2 Acondicionadores
de masa
|
Aditivos |
Límite
máximo mg/kg de producto |
|
Acido
ascórbico y sus sales de sodio y calcio |
BPF |
|
Carbonato
de calcio |
BPF |
|
Cloruro
de amonio |
BPF |
|
Dióxido
de silicio |
BPF |
|
Fumararo
de calcio |
BPF |
|
Fumarato
de potasio |
BPF |
|
Fumarato
de sodio |
BPF |
|
Lactato de sodio o calcio |
BPF |
|
Metabisulfito de sodio |
50 |
|
Mono
y diglicéridos de ácidos grasos |
BPF |
|
Oxido
de calcio |
BPF |
|
Sulfato
de calcio |
13 |
|
Triacetina |
BPF |
3.3 Antioxidantes
|
Aditivos |
Límite
máximo mg/kg de grasa |
|
Acido
ascórbico |
BPF |
|
Acido
fosfórico |
1300 |
|
Acido
isoascórbico |
BPF |
|
Alfa-tocoferol |
200 |
|
Ascorbato
de potasio |
BPF |
|
Ascorbato
de sodio |
BPF |
|
Bisulfito
de sodio |
50 |
|
Butilhidroxianisol
(BHA) |
200 |
|
Butilhidroxitolueno
(BHT) |
200 |
|
Galato
de propilo |
100 * 200** |
|
Isoascorbato
de sodio |
BPF |
|
Lecitina |
BPF |
|
Metabisulfito
de sodio o potasio |
50 |
|
Oleorresina
de paprika |
BPF |
|
Palmitato
de Ascorbilo |
1,000 |
|
Sulfito de potasio o sodio |
50 |
|
Terbutilhidroquinona
(TBHQ) |
200 |
|
Tiosulfato
de sodio |
50 |
|
Tocoferoles
mezclados |
BPF |
* Panadería ordinaria
** Pastelería fina
3.4 Colorantes
|
Aditivos |
Límite
máximo mg/kg de producto |
|
Amarillo
2G Amarillo
alimentos 5 No. C.I.
18965* |
100 |
|
Amarillo
ocaso FCF Amarillo
alimentos 3 No. C.I.
15985* |
300 |
|
Amarillo
alimentos 4 Tartrazina No. C.I.
19140 |
100 |
|
Azul
brillante FCF Azul
alimentos 2 y sus lacas No. C.I.
42090* |
500 (sólo para decoraciones) |
|
Beta
caroteno Anaranjado
alimentos 5 No. C.I.
40800 |
BPF |
|
Cantaxantina Anaranjado
alimentos 8 No. C.I.
40850 |
BPF |
|
Caramelo Clases
I, II y III |
BPF |
|
Caramelo
clase IV |
1200 |
|
Carotenos
naturales Anaranjado
alimentos 5 No. C.I.
75130 |
1,000 |
|
Clorofilas Verde natural 3 No. C.I. 75810 |
BPF |
|
Cúrcumina No. C.I.
75300 |
BPF |
|
Dióxido
de titanio Pigmento
blanco 6 No. C.I.
77891 |
10 000 ** |
|
Eritrosina Rojo alimentos 14 No. C.I. 45430* |
100 |
|
Extracto
de annato (Extracto
de semillas de Bixa orellana). Anaranjado
natural 4 No. C.I.
75120 |
10 |
|
Extracto
de cochinilla Rojo
natural 4 No. C.I.
75470 |
200 |
|
Extracto
de tegumento de uva No. C.I.
N.R. |
100 |
|
Indigotina Azul
alimentos 1 y sus lacas No. C.I.
73015* |
300 |
|
Oxido de
hierro amarillo No. C.I.
77492 |
75 |
|
Oxido de
hierro rojo No. C.I.
77491 |
75 |
|
Oxido de
hierro negro No. C.I.
77499 |
75 |
|
Ponceau
4R Rojo
cochinilla A Rojo
alimentos 7 No. C.I.
16255 |
50 |
|
Riboflavina |
300 (panadería) 1,000 (decoraciones) |
|
Rojo
allura AC Rojo
alimentos 17 No. C.I.
16035* |
300 |
|
Rojo
betabel o rojo remolacha |
BPF |
|
ß-apo-8-carotenal Anaranjado
alimentos 6 No. C.I.
40820 |
30 |
|
Verde
rápido F.C.F Verde
alimentos 3 No. C.I.
42053 |
100* |
Se pueden utilizar las lacas de
aluminio de los colorantes sintéticos antes mencionados, en una concentración
de uso que no exceda la concentración permitida del colorante del que proceda.
* Cuando se utilicen mezclas de
colorantes artificiales la suma de éstos no debe exceder de 500 mg/kg de
producto, respetando la concentración máxima de uso para cada uno de ellos.
** Uso exclusivamente en
productos de panificación con cobertura y relleno cremoso.
3.5 Conservadores
|
Aditivos |
Límite
máximo mg/kg de producto |
|
Acido
benzoico y sus sales de sodio |
1000 solo o combinado con otro conservador
permitido |
|
Acido
propiónico y sus sales de sodio o calcio |
BPF |
|
Acido
sórbico y sus sales de sodio y potasio |
1000 solo o combinado con otro conservador
permitido |
|
Diacetato
de sodio |
BPF |
|
Eritorbato
de sodio |
BPF |
|
Propil
parabeno |
1000 solo o combinado con otro conservador
permitido |
|
Sorbato
de calcio |
1000 |
|
Sorbato
de potasio |
1000 |
|
Sorbato
de sodio |
1000 |
* Cuando se utilicen mezclas de
conservadores la suma de éstos no deberá exceder el límite máximo del
conservador de mayor concentración.
3.6 Emulsivos,
estabilizadores, espesantes y gelificantes
|
Aditivos |
Límite
máximo |
|
Agar
agar |
BPF |
|
Alginato
de amonio, calcio, potasio y sodio |
BPF |
|
Almidones
modificados |
BPF |
|
Carboximetil
celulosa de sodio |
BPF |
|
Carboximetilcelulosa |
BPF |
|
Carragenatos de calcio, potasio o sodio |
BPF |
|
Carragenina |
BPF |
|
Celulosa
microcristalina |
BPF |
|
Cera de
carnauba |
BPF |
|
Dextrinas |
BPF |
|
Estearoil 2-lactilato de sodio o calcio |
5000 mg/kg de harina |
|
Esteres
acéticos de los mono y diglicéridos de los ácidos grasos |
BPF |
|
Esteres
acéticos y de ácidos grasos del glicerol |
BPF |
|
Esteres
cítricos de los mono y diglicéridos de los ácidos grasos |
BPF |
|
Esteres de ácido diacetil tartárico |
BPF |
|
Esteres
de poliglicerol de ácidos grasos |
10000 mg/kg de harina solo o combinado con
otro éster |
|
Esteres
de propilenglicol de ácidos grasos |
3750 mg/kg de harina |
|
Esteres
de sacarosa |
3750 mg/kg de producto |
|
Esteres
del ácido láctico de ácidos grasos |
BPF |
|
Esteres
lácticos y de ácidos grasos del glicerol |
BPF |
|
Fosfato de aluminio y sodio |
1g/kg de harina |
|
Fosfato de sodio |
BPF |
|
Goma Arábiga |
BPF |
|
Goma de Algarrobo |
BPF |
|
Goma Guar |
BPF |
|
Goma Karaya |
BPF |
|
Goma laca |
BPF |
|
Goma Tragacanto |
BPF |
|
Goma Xantano |
BPF |
|
Grenetina |
BPF |
|
Hidroxipropil metil celulosa |
BPF |
|
Lecitina |
BPF |
|
Maltodextrinas |
BPF |
|
Metil celulosa |
BPF |
|
Metil etil celulosa |
BPF |
|
Mono y diglicéridos de los
ácidos grasos |
BPF |
|
Monoestearato de Glicerilo |
BPF |
|
Monoestearato de sorbitán |
6100 mg/kg de harina |
|
Monoglicéridos acetilados |
BPF |
|
Monoglicéridos succinilados |
5g/kg de harina |
|
Monopalmitato de glicerilo |
BPF |
|
Pectinas |
BPF |
|
Polisorbato 60** |
3,000 sólo para decorados |
|
Polisorbato 65** |
3,000 sólo para decorados |
|
Polisorbato 80** |
3,000 sólo para decorados |
|
Sales de amonio de ácido fosfatídico |
BPF |
|
Triestearato de sorbitán |
10,000 mg/kg de
harina |
|
Tripolifosfato de sodio |
BPF |
** Cuando se utilicen mezclas de polisorbatos,
la suma de éstos no debe exceder del 1%, respetando la concentración máxima de
uso para cada uno de ellos.
3.7 Gasificantes o polvos para hornear
|
Aditivos |
Límite máximo mg/kg de harina |
|
Acido tartárico |
BPF |
|
Bicarbonato de amonio |
BPF |
|
Bicarbonato de potasio |
BPF |
|
Bicarbonato de sodio |
BPF |
|
Carbonato de sodio, amonio o
potasio |
BPF |
|
Fosfato monobásico de calcio |
5000 |
|
Pirofosfato ácido de sodio |
2500 |
|
Sulfato doble de aluminio y sodio |
BPF |
|
Tartrato ácido de potasio |
2500 |
3.8 Humectantes
|
Aditivos |
Límite
máximo |
|
Alginato
de propilenglicol |
5000 mg/kg de producto |
|
Glicerina |
BPF |
|
Propilenglicol |
5000 mg/kg de producto |
|
Sorbitol* |
300 g/kg de producto |
* Su uso está limitado a dicha
concentración tanto como humectante como edulcorante. La etiqueta del producto
que contenga este aditivo alimentario se
ajustará a lo establecido en
3.9 Leudante
|
Aditivos |
Límite
máximo |
|
Levadura |
BPF |
3.10 Reguladores de pH
|
Aditivos |
Límite
máximo |
|
Acetato
de sodio |
70 mg/kg de producto |
|
Acido
acético |
BPF |
|
Acido
cítrico |
BPF |
|
Acido
clorhídrico |
BPF |
|
Acido
fumárico y sus sales de sodio o potasio |
BPF |
|
Acido
láctico |
BPF |
|
Acido
málico |
BPF |
|
Carbonato
de amonio |
BPF |
|
Carbonato
de calcio |
BPF |
|
Citrato
de sodio o potasio |
BPF |
|
Citrato
dihidrogenado de sodio |
BPF |
|
Fosfato
diamónico |
9,300 |
|
Fosfato
dibásico de calcio |
2500 mg/kg de harina |
|
Fosfato
dibásico de sodio |
2500 mg/kg de harina |
|
Fosfato
hidrogenado diamónico |
9300 mg/kg de producto |
|
Fosfato
tricálcico |
5 mg/kg |
|
Hidróxido
de calcio |
BPF |
|
Hidróxido
de sodio |
BPF |
|
Lactato
de amonio |
BPF |
|
Lactato de sodio o calcio |
BPF |
3.11 Antiaglutinantes
|
Aditivos |
Límite
máximo |
|
Oxido de
magnesio |
BPF |
|
Silicato
de calcio |
BPF |
|
Silicato
de aluminio |
BPF |
|
Silicato
de aluminio y calcio |
BPF |
|
Silicato
de magnesio |
BPF |
|
Silicato
de sodio |
BPF |
|
Silicato
de sodio y magnesio |
BPF |
|
Talco |
BPF |
3.12
Gases de envasado
|
Aditivos |
Límite máximo |
|
Propano |
BPF |
3.13
Saborizantes y aromatizantes
En la elaboración de los productos objeto de
este apartado, se permite el empleo de los saborizantes o aromatizantes
establecidos en el Acuerdo.
APENDICE NORMATIVO B. MUESTREO
DE CEREALES
Generalidades
1. El muestreo debe ser realizado por un técnico
en muestreo con un instrumento de muestreo que permita obtener la muestra. En
el caso de producto en costales, el instrumento debe llegar al centro de cada
costal muestreado.
1.1 Adicionalmente, en el caso de
establecimientos, se debe tomar las muestras provenientes de las zonas de
calentamiento. Si no existen durante la visita, las tomará de las últimas zonas
de calentamiento registradas.
1.2 En los establecimientos, se debe solicitar
tomar la temperatura y la humedad de las muestras.
1.3 Se debe registrar, según sea el caso, el
área, número de costales o unidades de transporte muestreadas.
1.4 Las bodegas y almacenamientos en intemperie,
se dividen en zonas o áreas que contengan hasta 2000 ton, obteniéndose de cada
una, la muestra compuesta.
1.5 Se tomarán una o más muestras primarias en
cada uno de los puntos de muestreo que se establecen en C.3.1 cuando se trate
de producto a granel, o en 2.2 cuando se trate de producto en costales.
1.6 De la suma de las muestras primarias, se
constituirá una muestra compuesta, la que se homogeneizará, no debiendo ser
menor a 5 kg.
1.7 Dependiendo de la altura del volumen almacenado,
será el número de extracciones para cada punto de muestreo.
Tabla 1. Profundidad con que se
efectúe el muestreo
|
Profundidad m. |
Instrumento de muestreo |
No. de extracciones |
|
1 |
Sonda de alvéolos |
1 |
|
2 |
Sonda de bala, sonda de
alvéolos. |
3* |
|
3 |
Sonda de bala, sonda de
alvéolos. |
3* |
|
4 |
Sonda de bala. |
3* |
|
5 |
Sonda de bala. |
3* |
* Las muestras primarias deben obtenerse de
diferentes profundidades.
2. Puntos de muestreo.
2.1 Cereales almacenados a granel en bodegas o
almacenamientos en intemperie. Vista superior.
|
X |
|
X |
|
X |
|
|
X |
|
X |
|
|
X |
|
X |
|
X |
2.2 Cereales
almacenados a granel en silos. Vista superior.
2.2.1
Cuando debido al diseño del
silo no sea posible tomar las muestras primarias de la parte superior, se
tomarán de las escotillas.
2.3 Cereales almacenados en costales.
2.3.1
Se deben identificar las
estibas, cada una de las cuales se debe muestrear en forma de M imaginaria,
la que debe ir del primero al último tendido, el ancho máximo de la parte
inferior de la M no debe ser mayor a 5 m.
Esquema 3. Puntos de muestreo para producto en
costales.
2.3.2
Debe tomarse una muestra de
cada uno de los costales por donde pasen las líneas de la M trazada de
acuerdo a lo señalado en el esquema anterior.
2.3.3
El número mínimo de costales
a muestrear por lote, se ajustará a lo señalado en la tabla 1, si el número de
sacos almacenados es mayor que el número máximo considerado en la tabla, se
muestrearán los restantes como si fuera otro lote.
Tabla 2. Número mínimo de sacos
a muestrear por lote
Número de costales
|
En
lote |
A
muestrear |
|
hasta 99 |
10 |
|
100-199 |
15 |
|
200-299 |
20 |
|
300-499 |
30 |
|
500-799 |
40 |
|
800-1299 |
55 |
|
1300-3199 |
75 |
|
3200-7999 |
115 |
|
8000-21999 |
150 |
|
22000-49999 |
225 |
2.4 Muestreo de cereales en transportes.
2.4.1
Las Secretarías están
facultadas para efectuar el muestreo en unidades de transporte en cualquier
momento y lugar.
2.4.2 Puntos de
muestreo.
Esquema 4. Contenedores terrestres de hasta 30
toneladas. Vista superior.
Esquema 5. Contenedores terrestres mayores de
30 ton. Vista superior.
2.5 Muestreo en movimiento.
2.5.1 Las muestras
deben tomarse de los lugares o áreas donde el grano se encuentre en movimiento,
como durante las operaciones de carga y descarga de las bodegas,
almacenamientos en intemperie o durante los movimientos de transferencia entre
silos.
2.5.2 La cantidad de
muestra a obtener, será aproximadamente de 1 muestra primaria de
aproximadamente 500 g por cada 12,5 ton hasta obtener una muestra compuesta no
menor de 5 kg, pudiendo calcularse la frecuencia de introducción del
instrumento de muestreo con la siguiente ecuación:
M =
t/c
Donde:
M = frecuencia en min con
que se debe introducir el instrumento de muestreo.
t = toneladas
representadas por cada muestra primaria (ton/muestra).
c = capacidad de la banda
transportadora o capacidad de descarga del vehículo (ton/min).
3 Envío de muestras.
Las muestras deben
depositarse en bolsas nuevas de papel kraft, evitando su ruptura y etiquetarse
al momento de la toma de muestra, las etiquetas se ajustarán a lo establecido
en el siguiente formato:
3.1 Del etiquetado de
muestras.
3.1.1 Para muestras de
bodega.
Tipo de producto __________________________________________________________________
Centro: _________________________________________________________________________
Ubicación: ______________________________________________________________________
Bodega No.: _________________ Sección: ____________________________________________
Fecha toma de muestra:
_________________________________________
Hora:___________________________________________________________________________
Observaciones:___________________________________________________________________
Identificación
de la muestra:
3.1.2 Para muestras
durante la movilización.
Tipo de producto:__________________________________________________________________
Centro de envío: __________________________________________________________________
Ubicación: ______________________________________________________________________
Centro de destino: ________________________________________________________________
Ubicación:
______________________________________________________________________
Nombre
o Cía.: ___________________________________________________________________
Fecha
y hora de la toma de muestra: __________________________________________________
Datos
del vehículo: ________________________________________________________________
Identificación de la muestra:
3.2 Reporte de laboratorio.
Identificación de la muestra:
Centro:
_________________________________________________________________________
Ubicación:
______________________________________________________________________
Tipo
de producto:__________________________________________________________________
Nombre
de bodegas muestreadas: ___________________________________________________
Número
de muestras compuestas por bodega: __________________________________________
Concentración
en cada muestra compuesta: ____________________________________________
Concentración
promedio de AF en cada bodega: _________________________________________
Identificación de la muestra:
Fecha de realización del
análisis:
Vehículo muestreado:
________________________________
Centro de origen:
____________________________________
Centro de destino:
___________________________________
Concentración de AF:
__________________________
En
caso de resultar la concentración de AF mayor o igual a 20 µg/kg reportar a:__________________
_______________________________________________________________________________
Fecha de realización del
análisis: _________________________________________________________
15.3 Apéndice
normativo C. Métodos de Prueba
Indice
1 Determinación de materia extraña
1.1 Método para la
determinación de materia extraña pesada en harinas de cereales
1.2 Método para la
determinación de materia extraña ligera en harina de trigo
1.3 Método para la
determinación de materia extraña ligera en harina de maíz
1.4 Método para la
determinación de materia extraña ligera en harina de arroz
1.5 Método para la
determinación de materia extraña ligera en harina de cebada, harina de avena y
mezcla de cereales secos
1.6 Determinación de
materia extraña ligera en alimentos a base de cereales, de semillas
comestibles, de harinas, sémolas o semolinas o sus mezclas
1.7 Métodos para la
determinación de materia extraña en productos de panificación.
1.7.1 Método para la
determinación de materia extraña ligera (fragmentos de insectos, insectos
enteros, pelos de roedor y fragmentos de plumas) en productos horneados con
frutas y nueces.
1.7.2 Método para la
determinación de materia extraña ligera en pan blanco y productos con alto
contenido de grasa
1.7.3 Método para la
determinación de materia extraña ligera en panes con alto contenido de fibra
2 Método para
3 Método de prueba para la determinación de aflatoxinas en cereales.
4 Análisis microbiológico de productos objeto de esta norma
4.1 Procedimiento para
la preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis
microbiológico.
4.2 Método para la
cuenta de bacterias aerobias en placa.
4.3 Método para la
cuenta de microorganismos coliformes totales en placa.
4.4 Método para la
determinación de Salmonella en
alimentos.
4.5 Método para la
determinación de Staphylococcus aureus en
productos objeto de esta norma
4.6 Método para la
cuenta de mohos y levaduras en alimentos
5 Método de prueba para la determinacion de cadmio, plomo, fierro y zinc
en productos objeto de esta norma alimentos por espectrometría de absorción atómica.
6 Determinación de Vitamina B1 y B2 por Cromatografía Líquida de Alta
Resolución (HPLC).
7 Determinación de Niacina. Método microbiológico
8 Determinación de Acido Fólico. Método microbiológico.
1 Determinación de materia extraña
1.1 Método para la
determinación de materia extraña pesada en harinas de cereales
1.1.1 Fundamento.
La materia extraña se separa
por sedimentación y posteriormente se filtra para observación al microscopio.
1.1.2 Reactivos y
Materiales.
Todos los reactivos que a
continuación se mencionan deben ser grado analítico a excepción de los que se indican.
Cuando se indique agua debe
entenderse como agua destilada.
1.1.2.1 Reactivos.
Cloroformo (CHCl3).
Isopropanol (C3H8-OH).
Mezcla glicerina - alcohol
etílico 96% Alc. Vol. 1:3
(v/v) (C3H5) (OH)3 - C2H5-OH).
(Mezclar 1 volumen de glicerina
con 3 volúmenes de alcohol etílico)
1.1.2.2 Material.
Vasos de precipitados de 250
ml.
Papel de filtración rápida
rayado para conteo con líneas paralelas de aproximadamente 5 mm de separación.
Embudo Büchner.
Matraz Kitazato.
Material común de laboratorio.
1.1.3 Equipo.
Balanza analítica con 0,1 mg de
sensibilidad.
Equipo de filtración al vacío.
Microscopio binocular
estereoscópico con objetivos que pueden ser de 3, 6, 7 y 10x y oculares
apareados de amplio campo visual de 10, 30 y 100 x respectivamente.
Lámpara para el microscopio o
luz natural equivalente.
1.1.4 Procedimiento.
1.1.4.1 Pesar por
triplicado 50 g de muestra en un vaso de precipitados de 250 ml.
1.1.4.2 Añadir CHCl3
hasta 1 cm del borde, mezclar muy bien y dejar reposar por lo menos 30 min.
Revolver varias veces durante este lapso la capa que sube hasta la superficie.
1.1.4.3 Decantar el CHCl3 y
el tejido flotante a un papel filtro en un embudo Büchner. Cuidar de no remover
los residuos pesados del fondo del vaso. Antes de decantar hay que cuidar que
la capa que queda flotando no se haga tan compacta que dificulte esta
operación.
1.1.4.4 Añadir una
cantidad de isopropanol igual a la cantidad de cloroformo y sedimento que queda
en el vaso de precipitados; dejar que vuelva a reposar y decantar como antes.
1.1.4.5 Repetir este
proceso con una mezcla a partes iguales de cloroformo e isopropanol hasta que
quede muy poco tejido en el vaso. Debe tenerse cuidado de no decantar ningún
fragmento de materia extraña pesada que pueda estar presente.
1.1.4.6 Filtrar a través de un papel filtro rayado y lavar los residuos del
vaso con una fracción de cloroformo o isopropanol.
1.1.4.7 Pasar el papel filtro con el residuo a una caja Petri humedecida con la
mezcla de glicerina - alcohol etílico y así mantenerlo.
1.1.4.8 Contar al microscopio utilizando una luz suficientemente fuerte para
que muestre todos los detalles a través del microscopio. Contar y explorar con
la aguja de disección sobre toda la superficie del papel, línea por línea.
1.1.4.9 Voltear y explorar cada pieza del material ya que algunos fragmentos
son irreconocibles a menos que se muevan.
1.1.4.10 No contar material dudoso (una amplificación de 30x en algunos casos es
útil para examinar piezas dudosas).
1.1.4.11 Marcar el papel en un lado de cada fragmento y contar por medio de un
lápiz graso, para futuros chequeos y para evitar cuentas erróneas.
1.1.5 Reportar el promedio de las 3 determinaciones como excretas, arena y
alguna otra materia extraña pesada encontrada en 50 g de muestra.
1.2 Método para la determinación de materia extraña ligera en harina de
trigo
1.2.1 Fundamento.
Después de someter la muestra a una hidrólisis ácida, el material
considerado como materia extraña ligera se captura por flotación en aceite
mineral y posteriormente retenido en papel filtro para su observación al
microscopio.
1.2.2 Reactivos y materiales.
Todos los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado
analítico a menos que se indique otra especificación.
Cuando se indique agua debe entenderse como agua destilada.
1.2 2.1 Reactivos.
Acido clorhídrico (HCl) de 36,5 a 38,0% de pureza, con un peso específico
de 1,185 - 1,192.
Acido clorhídrico al 3%. Diluir 3 volúmenes de ácido clorhídrico en 97
volúmenes de agua (v/v).
Solución de detergente al 5% (p/v).
i) En un vaso de precipitados de 100 ml pesar 5 g de laurilsulfato de
sodio.
ii) Disolver con agua y trasvasar cuantitativamente a un matraz volumétrico
de 100 ml enjuagando varias veces con agua y llevar al aforo.
Aceite mineral ligero con un peso específico (24°C)
de 0,840 - 0,860 y una viscosidad (40°C) de 45 - 55 cSt.
Mezcla glicerina - alcohol etílico 96% Alc. Vol. 1:3 (v/v) (C3H5)
(OH)3 - C2H5-OH)
i) Mezclar 1 volumen de glicerina con 3 volúmenes de alcohol etílico.
1.2.2.2 Materiales.
Vasos de precipitados de 100, 250, 1000 y 2000 ml.
Matraz Kitazato.
Embudo Büchner.
Embudo percolador o embudo Kilborn.
Caja Petri.
Aguja de disección.
Parrilla de calentamiento con agitación.
Papel de filtración rápida rayado para conteo con líneas paralelas de
aproximadamente 5 mm de separación.
Material común de laboratorio.
1.2.3 Equipo.
Balanza analítica con 0,1 mg de sensibilidad.
Equipo de filtración al vacío.
Agitador magnético.
Microscopio binocular estereoscópico con objetivos que pueden ser de 3,
6, 7 y 10x y oculares apareados de amplio campo visual de 10, 30 y 100x
respectivamente.
Lámpara para el Microscopio o luz natural equivalente.
1.2.4 Procedimiento.
1.2.4.1 Digerir por triplicado 50 g de harina en un vaso de precipitados de
2000 ml con 600 ml de ácido clorhídrico al 3% en un autoclave por 5 min a
121°C. Dejar que la presión baje a cero y abrir la válvula de ventilación.
Transferir inmediatamente el digerido a un vaso de precipitados de 1000 ml,
enjuagando con ácido clorhídrico al 3% a temperatura ambiente.
1.2.4.2 Adicionar 50 ml de aceite mineral y agitar magnéticamente por 5 min,
transferir a un embudo percolador conservando el vaso. Dejar reposar por 30 min
y agitar muy suavemente con una varilla de vidrio varias veces, durante los
primeros 10 min.
1.2.4.3 Drenar la capa inferior hasta aproximadamente 3 cm de la interfase.
Lavar los lados con agua fría y dejar que las capas se separen por un tiempo
aproximado de 2 a 3 min. Repetir el drenado y lavado con agua hasta que la fase
inferior esté clara. Después del lavado final, drenar la capa de aceite en el
vaso original y enjuagar los lados del embudo con agua y alcohol etílico.
1.2.4.4 Agregar ácido clorhídrico al 3% y llevar a ebullición por 3 a 4 min en
una parrilla de calentamiento. Filtrar (usando un embudo Büchner y sistema de
vacío) la solución caliente a través de un papel filtro rayado y enjuagar perfectamente
el vaso y embudo con agua, alcohol y una solución de detergente al 5%. Filtrar
en forma separada cada enjuague a través del mismo papel filtro.
1.2.4.5 Examinar el papel en el microscopio como en el método 1 según los
puntos 1.1.4.7 al 1.1.4.11
1.2.4.6 Reportar el promedio de las 3 determinaciones como fragmentos de
insectos, pelos de roedor y alguna otra materia extraña ligera encontrados en
50 g de muestra.
1.3 Método para la determinación de materia extraña ligera en harina de maíz
1.3.1 Fundamento.
Después de someter la muestra a una hidrólisis ácida, el material
considerado como materia extraña ligera se captura por flotación en aceite
mineral y posteriormente retenido en papel filtro para su observación al
microscopio.
1.3.2 Reactivos y Materiales.
Todos los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado
analítico a menos que se indique otra especificación.
Cuando se indique agua debe entenderse agua destilada.
1.3.2.1 Reactivos.
Acido clorhídrico (HCl) de 36,5 a 38,0% de pureza y con un peso
específico de 1,185 - 1,192.
i) Acido clorhídrico al 5%. Diluir 5 volúmenes de ácido clorhídrico en 95
volúmenes de agua (v/v).
Solución de detergente al 5% (v/v).
i) En un vaso de precipitados de 100 ml pesar 5 g de laurilsulfato de
sodio.
ii) Disolver con agua y trasvasar cuantitativamente a un matraz volumétrico
de 100 ml enjuagando varias veces con agua y llevar al aforo.
Aceite mineral ligero. Con un peso específico
(24°C) de 0,840-0,860 y una viscosidad (40°C) de 45 - 55 cSt.
Keroseno deodorizado.
Mezcla glicerina - alcohol etílico 96% Alc. Vol. 1:3 (v/v) (C3H5)
(OH)3 - C2H5-OH)
i) Mezclar 1 volumen de glicerina con 3 volúmenes de alcohol etílico.
1.3.2.2 Material.
Vasos de precipitados de 100, 250, 1000 y 2000 ml.
Matraz Kitazato.
Embudos de extracción.
Embudo de Hirsch.
Caja Petri.
Aguja de disección.
Parrilla de calentamiento con agitación.
Papel de filtración rápida rayado para conteo
con líneas paralelas de aproximadamente 5 mm de separación.
Material común de laboratorio.
1.3.3 Equipo.
Balanza analítica con 0,1 mg de sensibilidad.
Equipo de filtración al vacío.
Agitador magnético.
Microscopio binocular estereoscópico con
objetivos que pueden ser de 3, 6, 7 y 10x y oculares apareados de amplio campo
visual de 10, 30 y 100x respectivamente.
Lámpara para el microscopio o luz natural
equivalente.
1.3.4 Procedimiento.
1.3.4.1 Dispersar por triplicado 50 g de harina en
vasos de precipitados de 1000 ml con 400 ml de ácido clorhídrico al 5% (v/v) y
de 20 ml de aceite mineral. Colocar el vaso en una parrilla de calentamiento y
llevar a ebullición agitando constantemente (con agitador magnético). Hervir
por 10 min.
1.3.4.2 Quitar el vaso de la parrilla de
calentamiento y pasar su contenido a un embudo de extracción. Enjuagar el vaso
y la varilla con 50 ml de agua caliente, pasar los enjuagues al embudo de
extracción y retener el vaso y la varilla. Llenar el embudo con agua fría hasta
aproximadamente 3 cm abajo de la parte superior.
1.3.4.3 Dejar sedimentar por espacio de 30 min y
drenar la capa inferior hasta aproximadamente
1.3.4.4 Lavar las paredes del embudo de extracción
con una solución de detergente al 5% y colectar los lavados en el vaso
retenido. Filtrar el contenido completo del vaso con una solución de detergente
al 5% y filtrar a través del mismo papel.
1.3.4.5 Examinar el papel en el microscopio como en
el método 1 según los puntos 1.1.4.7 al 1.1.4.11.
1.3.4.6 Reportar el promedio de las 3 determinaciones
como fragmentos de insectos, pelos de roedor y alguna otra materia extraña
ligera encontrados en 50 g de muestra.
1.4 Método para la determinación de materia
extraña ligera en harina de arroz
1.4.1
Fundamento.
Después de someter la muestra a una hidrólisis
ácida, el material considerado como materia extraña ligera se captura por
flotación en aceite mineral y posteriormente retenido en papel filtro para su
observación al microscopio.
1.4.2
Reactivos y Materiales.
Todos los reactivos que a continuación se
mencionan deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación.
Cuando se indique agua debe entenderse como
agua destilada.
1.4.2.1 Reactivos.
Acido clorhídrico (HCl) de 36,5 a 38,0% de
pureza y con un peso específico de 1,185 - 1,192.
i) Acido clorhídrico al 5%. Diluir 3 volúmenes
de ácido clorhídrico en 97 volúmenes de agua (v/v).
Solución de detergente al 1% (p/v).
i) En un vaso de precipitados de 100 ml pesar 1
g de laurilsulfato de sodio.
ii) Disolver con agua y trasvasar
cuantitativamente a un matraz volumétrico de 100 ml enjuagando varias veces con
agua y llevar al aforo.
Aceite mineral ligero.
Con un peso específico (24°C) de 0,840 - 0,860 y una viscosidad (40°C) de 45 -
55 cSt.
Isopropanol (CH3)2
CHOH al 40% (v/v).
Diluir 40 ml de isopropanol con agua en un
matraz volumétrico de 100 ml y llevar al volumen.
Mezcla glicerina - alcohol etílico 96% Alc.
Vol. 1:3 (v/v) (C3H5) (OH)3 - C2H5-OH).
i) Mezclar 1 volumen de glicerina con 3 volúmenes
de alcohol etílico.
1.4.2.2 Material.
Vasos de precipitados de 100,
250, 1000 y 2000 ml.
Matraz Kitazato.
Embudos Büchner.
Embudo percolador o embudo
Kilborn.
Caja Petri.
Aguja de disección.
Parrilla de calentamiento con
agitación.
Papel de filtración rápida
rayado para conteo con líneas paralelas de aproximadamente 5 mm de separación.
Tamiz con número de malla 230.
Material común de laboratorio.
1.4.3 Equipo.
Balanza analítica con 0,1 mg de
sensibilidad.
Equipo de filtración al vacío.
Agitador magnético.
Microscopio binocular
estereoscópico con objetivos que pueden ser de 3, 6, 7 y 10x y oculares
apareados de amplio campo visual de 10, 30 y 100x respectivamente.
Lámpara para el Microscopio o
luz natural equivalente.
1.4.4 Procedimiento.
1.4.4.1 Preparación de
la muestra.
i) Precalentar la
parrilla a la máxima temperatura. Colocar la barra magnética en un vaso de
precipitados de 2000 ml. Adicionar 100 g de muestra y 100 ml de agua caliente
de forma rápida y vigorosa. Agregar 75 ml de ácido clorhídrico y llevar a la
marca de 800 ml con agua caliente. Hacer esta determinación por triplicado.
ii) Colocar la mezcla
caliente en la parrilla con agitación y agitar vigorosamente hasta ebullición.
Hervir por espacio de 5 min.
iii) En pequeñas
cantidades transferir la mezcla caliente a través de un tamiz con número de
malla 230. Guardar el vaso de precipitados.
iv) Lavar el residuo
que queda en el tamiz con agua caliente a chorro constante hasta que disminuya
el espumado y el agua salga cristalina.
v) Transferir el
residuo a un vaso de 2000 ml con isopropanol al 40%. Colocar la barra magnética
y llevar con isopropanol al 40% hasta la marca de 800 ml. Colocar en la
parrilla y calentar a ebullición con agitación constante. Adicionar 95 ml de
aceite mineral y llevar a ebullición durante 3 min.
vi) Fijar el embudo de
separación (percolador) y adicionar 300 ml de isopropanol al 40%. Transferir la
mezcla caliente por la parte superior del embudo (percolador). Enjuagar el vaso
de 2000 ml con isopropanol al 40% y vaciar el enjuagado en el embudo de
separación (percolador). Con el mismo vaso adicionar suficiente isopropanol al
40% (aproximadamente 1000 ml) hasta 3 cm antes de la parte superior del embudo.
vii) Dejar reposar 5
min y drenar el contenido hasta 5 cm antes del fondo de la capa de aceite.
viii) Repetir el
llenado a intervalos de 2 min con agua caliente hasta que la fase acuosa sea
clara.
ix) Drenar la capa de
aceite dentro de un vaso de precipitados de 1000 ml. Enjuagar el embudo de
separación (percolador) por las paredes con constantes lavados de agua e
isopropanol al 40%, colectar los lavados en el mismo vaso de precipitados de
1000 ml y enjuagar finalmente con una solución de detergente al 1%. Filtrar a
través del papel filtro rayado.
x) Examinar el papel
en el microscopio como en el método 1 según los puntos 1.1.4.7 al 1.1.4.11.
xi) Reportar el
promedio de las 3 determinaciones como fragmentos de insectos, pelos de roedor
y alguna otra materia extraña ligera encontrados en 50 g de muestra.
1.5 Método para la
determinación de materia extraña ligera en harina de cebada, harina de avena y mezcla de cereales secos
1.5.1 Fundamento
Después de someter la muestra a
una hidrólisis ácida el material considerado como materia extraña ligera se
captura por flotación en aceite mineral y posteriormente retenido en papel
filtro para su observación al microscopio.
1.5.2 Reactivos y
Materiales
Todos los reactivos que a
continuación se mencionan deben ser grado analítico a menos que se indique otra
especificación.
Cuando se indique agua debe
entenderse como agua destilada.
1.5.2.1 Reactivos
Acido clorhídrico (HCl) de 36,5
a 38,0% de pureza y con un peso específico de 1,185 - 1,192.
i) Acido clorhídrico
al 3%. Diluir 3 volúmenes de ácido clorhídrico en 97 volúmenes de agua (v/v).
Aceite
mineral ligero. Con un peso específico (24°C) de 0,840 - 0,860 y una viscosidad
(40°C) de 45 - 55 cSt.
Mezcla glicerina - alcohol
etílico 96% Alc. Vol. 1:3 (v/v) (C3H5) (OH)3 - C2H5-OH)
ii) Mezclar 1 volumen
de glicerina con 3 volúmenes de alcohol etílico.
Isopropanol (CH3)2
CHOH al 40% (v/v).
iii) Diluir 40 ml de
isopropanol con agua en un matraz volumétrico de 100 ml y llevar al aforo.
Mezcla isopropanol al 40% -
tween 80 o equivalente (1:1)
iv) A 40 ml de tween
80, adicionar 210 ml de isopropanol al 40%, mezclar y filtrar (se pueden
preparar volúmenes proporcionales).
Mezcla isopropanol al 40%- Sal
disódica de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)
v) Disolver 5 g de sal
disódica de EDTA en 150 ml de agua, agregar 100 ml de isopropanol al 40%
mezclar y filtrar (se pueden preparar volúmenes proporcionales).
Igepal
(Dialquilfenoxipolietilenoxietanol) o emulsificante equivalente.
1.5.2.2 Material
Vasos de precipitados de 100,
600, 1000 y 2000 ml
Matraz trampa de Wildman de
1000 o 2000 ml
Embudos para polvos
Embudo de Büchner
Matraz Kitazato
Caja Petri
Tamiz con número de malla 230
Aguja de disección
Parrilla de calentamiento con
agitación
Papel de filtración rápida
rayado para conteo con líneas paralelas de aproximadamente 5 mm de separación.
Material común de laboratorio.
1.5.3 Equipo
Balanza analítica con 0,1 mg de
sensibilidad
Equipo de filtración al vacío
Agitador magnético
Microscopio binocular
estereoscópico con objetivos que pueden ser de 3, 6, 7 y 10x y oculares
apareados de amplio campo visual de 10, 30 y 100x respectivamente.
Lámpara para el Microscopio o
luz natural equivalente.
1.5.4 Procedimiento
1.5.4.1 Pesar por
triplicado
1.5.4.2 En la parrilla
precalentada al máximo calor, colocar el vaso. Al inicio agitar vigorosamente
para evitar que se queme, después volver a agitar suavemente para mezclar y
calentar durante 20 min. Si el producto se obscurece, reducir la intensidad de
la temperatura.
1.5.4.3 Transferir el
contenido del vaso a un tamiz con número de malla 230 y lavarla bajo una fuerte
corriente de agua, hasta que ésta salga clara, lavar el residuo colocando la
muestra sobre uno de los lados del
tamiz.
1.5.4.4 Empapar el
residuo húmedo con isopropanol y dejarlo drenar. Formar una copa de papel
filtro y envolver éste alrededor de un vaso de precipitados de 600 ml e
introducir la copa de papel en el vaso de precipitados de 1000 ml.
1.5.4.5 Con la ayuda
de un embudo para polvos, llevar el matraz trampa con isopropanol al 40%
dejándolo caer lentamente por la varilla de agitación. Dejar reposar por 30 min
y atrapar. Adicionar 35 ml de aceite mineral agitar suavemente a mano por 30
segundos y dejar reposar 10 min. Volver a entrampar, filtrar sobre papel filtro
rayado.
1.5.4.6 Examinar el
papel en el microscopio como en el método 1 según los puntos 1.1.4.7 al
1.1.4.11.
1.5.4.7 Reportar el
promedio de las 3 determinaciones como fragmentos de insectos, pelos de roedor y alguna otra materia extraña ligera
encontrados en
1.6 Determinación de
materia extraña ligera en alimentos a base de cereales, de semillas
comestibles, de harinas, sémolas o semolinas o sus mezclas
1.6.1 Fundamento
Después de someter la muestra a
una hidrólisis ácida el material considerado como materia extraña ligera se
captura por flotación en aceite mineral y posteriormente retenido en papel
filtro para su observación al microscopio.
1.6.2 Reactivos y
materiales
Todos los reactivos que a
continuación se mencionan deben ser grado analítico a menos que se indique otra
especificación.
Cuando se indique agua debe
entenderse agua destilada.
1.6.2.1 Reactivos
Acido clorhídrico (HCl) de 36,5
a 38,0% de pureza y con un peso específico de 1,185-1,192.
Aceite
mineral ligero. Con un peso específico (24°C) de 0,840-0,860 y una viscosidad
(40°C) de 45-55 cSt.
Mezcla glicerina - alcohol
etílico de 96% alc. vol. 1:3 (v/v)
(C3H5)(OH)3 -
C2H5-OH)
i) Mezclar 1 volumen
de glicerina con 3 volúmenes de alcohol etílico.
Isopropanol (CH3)2CHOH
al 40% (v/v).
ii) Diluir 40 ml de
isopropanol con agua en un matraz volumétrico de 100 ml y llevar al aforo.
Igepal
(Dialquilfenoxipolietilenoxietanol) o el equivalente como tween.
1.6.2.2 Material
Vasos de precipitados de 100,
600, 1000 y 2000 ml
Matraz trampa de Wildman de
1000 o 2000 ml o percolador o embudo de Kilborn
Embudo Büchner
Matraz Kitazato
Caja Petri
Agitador magnético
Tamiz con número de malla 230
Aguja de disección
Papel de filtración rápida
rayado para conteo con líneas paralelas de aproximadamente 5 mm de separación
Material común de laboratorio
1.6.3 Aparatos e
Instrumentos
Parrilla de calentamiento con
agitación
Balanza analítica con 0,1 mg de
sensibilidad
Equipo de filtración al vacío
Microscopio binocular
estereoscópico con objetivos que pueden ser de 3, 6, 7 y 10x y oculares
apareados de amplio campo visual de 10, 30 y 100x respectivamente
Lámpara para el microscopio o
luz natural equivalente.
1.6.4 Procedimiento
1.6.4.1 Para productos
de bajo contenido de grasas o aceites:
Pesar por triplicado 50 g de
muestra en un vaso de precipitados de 1 o 1,5 litros (dependiendo del volumen
del producto) adicionar 500 ml de agua caliente (55-70°C) y 40 ml de HCl.
Colocar en una parrilla con agitación magnética, calentar la mezcla hasta
ebullición agitando suavemente durante 20 min.
Transferir el contenido del
vaso a un tamiz con número de malla 230 y lavarla bajo una fuerte corriente de
agua, hasta que ésta salga clara, lavar el residuo colocando la muestra sobre
uno de los lados del tamiz, lavando con isopropanol al 40%. Transferir el
contenido del tamiz al matraz trampa de Wildman o regresarlo al vaso original
si se va a emplear el percolador.
i) Procedimiento con
el matraz trampa
Con isopropanol al 40% llevar a
un volumen de 800 ml y adicionar 30 ml de HCl, colocar el matraz sobre una
parrilla con agitación magnética. Subir la varilla de agitación arriba del
nivel del líquido sosteniéndola con una pinza. Colocar una barra magnética y
con agitación suave hervir la muestra durante 5 min. Adicionar 50 ml de aceite mineral y agitar 3 min. Quitar
el matraz de la parrilla y lavarlo con isopropanol al 40%. Dejar reposar 10 min
y entrampar enjuagando el cuello del matraz con isopropanol o alcohol. Filtrar
sobre papel filtro rayado. Examinar al microscopio.
ii) Procedimiento para
el percolador o embudo de Kilborn
En el vaso original de la
muestra llevar a un volumen de 600 ml con isopropanol al 40% y adicionar 25 ml
de HCl. Llevar a ebullición con agitación suave, hervir durante 5 min, agregar
50 ml de aceite mineral y agitar 3 min.
Transferir el contenido del
vaso al percolador enjuagando el vaso sobre éste con isopropanol al 40%.
Si el residuo en el separador
es pesado, resuspenderlo con una varilla de vidrio, enjuagándola dentro del percolador.
Dejar reposar por 3 min y
drenar el contenido hasta 3 cm antes de llegar a la parte superior de la capa
de aceite, volver a llenar con agua caliente (55-70°C), repetir la operación de
drenado y llenar con agua caliente con intervalos de 3 min hasta que la fase
acuosa quede libre de "material plant" (material entrampable).
Desechar los drenados. Drenar
la capa oleosa, recibiéndola en el vaso original, lavando las paredes del
percolador alternativamente con isopropanol o agua caliente y alcohol, usando
un gendarme de hule para lavar las paredes.
Filtrar el contenido del vaso
sobre papel rayado. Examinar al microscopio.
1.6.4.2 Para productos
que contienen alto contenido de grasas o aceite:
Proceder como en 1.6.4.1,
previa adición de 20 ml del emulsificante (Igepal o su equivalente).
1.6.5 Informe de la
prueba
Reportar el promedio de las
tres determinaciones como fragmentos de insectos, pelos de roedor y alguna
materia extraña ligera encontradas en 50 g de muestra.
1.7 Métodos para la
determinación de materia extraña en productos de panificación.
1.7.1 Método para la
determinación de materia extraña ligera (fragmentos de insectos, insectos
enteros, pelos de roedor y fragmentos de plumas) en productos horneados con
frutas y nueces.
Método por Hidrólisis Acida.
1.7.1.1 Fundamento
Después de someter la muestra a
una hidrólisis ácida el material considerado como materia extraña ligera se
capta por flotación en heptano y es posteriormente retenido en papel filtro
para su observación al microscopio.
1.7.1.2 Reactivos y
Materiales
Todos los reactivos que a
continuación se mencionan deben ser grado analítico a menos que se indique otra
especificación.
Cuando se indique agua deberá
entenderse agua destilada.
i) Reactivos.
Acido clorhídrico (HCl) de 36,5
a 38,0% de pureza y con un peso específico de 1,185 - 1,192
Alcohol etílico (C2H5OH)
al 95% puede emplearse alcohol comercial sin desnaturalizar.
Alcohol etílico al 60%
En un matraz volumétrico de 1 litro adicionar
631,6 ml de alcohol de 95% y llevar al volumen con agua.
Cloroformo (CHCl3)
Heptano C7H6
puede emplearse n-heptano comercial con un contenido máximo de 8% de tolueno.
Mezcla glicerina-alcohol etílico (C3H5(OH)3 C2H5OH)
1:3 v/v
Mezclar 1 volumen de glicerina con 3 volúmenes
de alcohol etílico al 95%.
Solución de acetato de etilo (C4H8O2)
solución acuosa saturada.
Solución antiespumante: Diluir 1g de
antiespumante con 20 ml de solución de acetato de etilo, usar el sobrenadante y
mantener el envase perfectamente cerrado.
ii) Materiales.
Vaso de precipitados de 100, 250, 1000 y 2000
ml.
Vidrios de reloj.
Matraces volumétricos de diferentes
capacidades.
Matraz trampa de Wildman, compuesto de
Imetraz.
Matraz Erlenmeyer de 1 a 12 litros previsto de
un tapón émbolo de hule sujeto al extremo de una varilla metálica.
Embudo Büchner.
Caja Petri.
Aguja de disección.
Papel de filtración rápida rayado para conteo
con líneas paralelas de aproximadamente 5 mm de separación.
Tamiz con No. de malla 140 de 5 a 8 pulgadas
de diámetro.
1.7.1.3
Equipo
Autoclave
Balanza analítica con sensibilidad de 0,1 mg
Sistema para filtrar al vacío
Placa de calentamiento
Microscopio binocular estereoscópico con
objetivos que pueden ser 3, 6, 7, 10x y oculares apareados de amplio campo
visual de 10, 30 y 100x respectivamente.
Lámpara para el microscopio o luz natural
equivalente.
1.7.1.4
Procedimiento
Agregar 225 g de muestra a un vaso de
precipitados de 2 litros que contenga 1 litro de agua y 30 ml de ácido
clorhídrico concentrado.
Humedecer completamente el producto y agitar
hasta que la suspensión esté prácticamente libre de grumos. Agregar la solución
antiespumante y tapar con un vidrio de reloj, calentar de 15 a 20 min en
autoclave a 121°C. Dejar que la presión baje a 0 antes de abrir la válvula de
ventilación.
Transferir el digerido en pequeñas porciones
al tamiz de malla No. 140 y lavar perfectamente entre adiciones con la pasta
rociadora de una piseta. Después de que toda la muestra ha sido transferida,
continuar con el lavado hasta que no haya reducción en la cantidad del residuo.
Después de completar los lavados (sin material
almidonoso visible libre de salvado), lavar dos veces en forma alternativa con
alcohol y cloroformo en ese orden, después enjuagar perfectamente con alcohol y
finalmente con agua.
Transferir el material a un papel filtro si es
que hay poco residuo a un matraz trampa de 1 o 2 litros si hay mucho residuo.
Usar una cuchara para transferir la mayor
parte del material.
Enjuagar el residuo del tamiz con una piseta
que contenga alcohol al 60%, lavar la malla con un chorro constante de agua
caliente, colectando el residuo final en un borde de la malla, pasarlo al
matraz trampa con la ayuda de la piseta de alcohol al 60%. Agregar 400 o 900 ml
de alcohol al 60% dependiendo del tamaño del matraz.
Hervir por 20 min. Enfriar abajo de 20°C y adicionar 20 o 40 ml de
heptano, llevar al matraz con alcohol al 60% y sifonear 2 veces.
Tener cuidado en la agitación y adición del alcohol para prevenir
emulsiones o inclusión de aire si el residuo en el matraz tiende a elevarse,
agitar el material hacia abajo 2 o 3 veces.
Filtrar con el fin de retener el material y examinar el microscopio.
Pasar el papel filtro con el residuo o una caja Petri humedecida con la
mezcla de glicerina-alcohol etílico y así mantenerlo.
Contar al microscopio utilizando una luz suficientemente fuerte para que
muestre todos los detalles a través del microscopio, contar y explorar con la
aguja de disección sobre toda la superficie del papel, línea por línea voltear
y explorar cada pieza del material, ya que algunos fragmentos son
irreconocibles a menos que se muevan.
No contar material dudoso, una amplificación de 30X en algunos casos es
útil para examinar piezas dudosas.
Marcar el papel en un lado de cada fragmento contado, por medio de un
lápiz graso, para futuros chequeos y para evitar cuentas erróneas.
Repetir el conteo para los fragmentos de insectos, pelos de roedor,
incrustados en 225 g de muestra.
1.7.2 Método para la determinación de materia extraña ligera en pan blanco y
productos con alto contenido de grasa
1.7.2.1 Fundamento
Después de someter a la muestra a una digestión el material considerado
como materia extraña ligera se capta por flotación en aceite y es
posteriormente retenido en papel filtro para su observación al microscopio.
1.7.2.2 Reactivos y Materiales
i) Reactivos
Acido Clorhídrico HCl de 36,5 a 38,0% de pureza y con un peso específico
de 1,185 - 1,192
Aceite mineral ligero con peso específico (24°C) de 0,840 - 0,860 y una
viscosidad (40°C) de 45 - 55 cSt.
Alcohol etílico (C2H5OH) al 95% se puede emplear alcohol comercial
sin desnaturalizar.
Isopropanol (CH3)2CHOH
Solución de acetato de etilo (C4H8O2), solución acuosa saturada.
Solución antiespumante. Diluir 1 g de antiespumante con 20 ml de solución
de acetato de etilo, usar el sobrenadante y mantener el envase perfectamente
cerrado.
Emulsificantes. Surfactantes no iónicos, solubles en agua,
A-Nonilfenoxipoli (etilenoxi) etanol; Igepal CO-730 o equivalente.
Beta- Dialquilfenoxi Poli (etilenoxi) etanol Igepal DM-710
Detergente al 5% (p/v). Disolver 5 g de lauril sulfato de sodio y llevar
al volumen de 100 ml
ii) Material
Vasos de precipitados de 100, 250, 1000 y 2000 ml
Matraces volumétricos de diferentes capacidades
Vidrios de reloj
Caja Petri
Aguja de disección
Embudo percolador o Embudo Kilborn
Varilla de vidrio
Tamiz con malla No. 230
Papel de filtración rápida rayado para conteo con líneas paralelas de
aproximadamente 5 mm de separación.
iii) Equipo
Balanza analítica con sensibilidad de 0,1 mg
Agitador magnético
Placa de calentamiento con agitación magnética
Microscopio binocular estereoscópico con
objetivos que pueden ser 3, 6, 7 y 10x y oculares apareados de amplio campo
visual de 10, 30 y 100x respectivamente
Lámpara para el microscopio o luz natural
equivalente
1.7.2.3 Procedimiento
Agregar 1 litro de agua caliente (55 a 70°C) a
un vaso de 2 litros añadir 20 ml del emulsificante B y 5 ml del emulsificante A
y mezclar bien.
Agregar 225 g de muestra y cortar el pan en
trozos de menos de 1 pulgada cuadrada y agitar bien.
La digestión puede efectuarse de dos formas:
i) Autoclave. Agregar con agitación 30 ml de
ácido clorhídrico concentrado. Añadir 1 ml de solución antiespumante, calentar
en el autoclave por 30 min a 121°C, dejar que la presión baje a 0 antes de
abrir la válvula de ventilación.
ii) Baño de vapor. Agregar con agitación 90 ml de
ácido clorhídrico concentrado. Calentar en baño de vapor por 10 min. Agregar 1
ml de solución antiespumante. Hervir 15 min sobre una placa de calentamiento con
agitación magnética, mantener el vaso cubierto con un vidrio de reloj.
iii) Humedecer la malla No. 230, moviéndola en
zigzag, con agua caliente (55 a 75°C). Tamizar hasta que el chorro esté claro y
la espuma desaparezca. Transferir el residuo retenido en la malla al vaso
original (Precaución. No permitir que la muestra en el vaso o la malla se
enfríe). Agregar 30 ml de ácido clorhídrico concentrado y diluir a 1 litro con
agua. Agitar en el agitador magnético y llevar a ebullición. Hervir por 6 min y
agregar 50 ml de aceite mineral y continuar con el calentamiento hasta que se
reanude la ebullición. Transferir el vaso a una placa de calentamiento fría con
agitación magnética y agitar por 3 min.
iv) Inmediatamente pasar el contenido del vaso a
un percolador que contiene aproximadamente 250 ml de agua. Enjuagar el vaso en
el percolador y llevar el volumen a la marca de 1700 con agua. Después de 1
min, agitar el contenido del percolador con una varilla de vidrio. Colocar la
varilla en el vaso y apartarla para recibir el drenado final de aceite. Dejar
reposar 2 min. Drenar el aceite hasta la marca de 250 ml y descartar los
drenados. Volver a llenar el percolador con agua. Continuar con el drenado y
llenado hasta que la fase acuosa inferior esté casi clara. Drenar el aceite
hasta la marca de 250 ml. Drenar el aceite en el vaso original. Lavar las
paredes del percolador con al menos 50 ml de agua y alcohol o isopropanol. Si
las paredes no se ven limpias, siga los lavados con agua y detergente al 5%.
Filtrar sobre un papel rayado y examinar al microscopio.
Examinar al microscopio como en el método
1.7.1
Reportar los fragmentos de insectos, pelos de
roedor encontrados en 225 g de muestra.
1.7.3
Método para la determinación
de materia extraña ligera en panes con alto contenido de fibra
1.7.3.1 Fundamento
Después de someter la muestra a una digestión,
el material considerado como materia extraña ligera se capta por flotación en
aceite y es posteriormente retenido en papel filtro para su observación al
microscopio.
1.7.3.2 Reactivos y Materiales.
i) Reactivos.
Acido Clorhídrico HCL de 36,5 a 38,0% de
pureza y con un peso específico de 1,185 - 1,192
Aceite mineral ligero con
un peso específico (24°C) de 0,840 - 0,860 y una viscosidad (40°C) de 45-55
cSt.
Alcohol etílico (C2H5OH)
al 95%, se puede emplear alcohol comercial sin desnaturalizar.
Isopropanol (CH3)2CHOH
Solución de Acetato de Etilo (C4H8O2),
solución acuosa saturada.
Solución antiespumante. Diluir 1 g de
antiespumante con 20 ml de acetato de etilo, usar el sobrenadante y mantener el
envase perfectamente cerrado.
Detergente al 5% (p/v). Disolver 5 g de lauril
sulfato de sodio y llevar al aforo a 100 ml.
Solución alcohol-ácido. Mezclar una parte de
ácido clorhídrico concentrado, con 9 partes de isopropanol al 40%.
ii) Material
Vaso de precipitados de 100, 250, 1000 y 2000
ml.
Matraces volumétricos de diferentes
capacidades.
Embudo percolador o embudo Kilborn
Varilla de vidrio
Gendarme
Tamiz con No. de malla 140
Papel de filtración rápida rayado para conteo
con líneas paralelas de aproximadamente 5 mm de separación.
iii) Equipo
Autoclave
Balanza analítica con 0,1 mg de sensibilidad.
Agitador magnético.
Placa de calentamiento con agitación magnética
Microscopio binocular estereoscópico con
objetivos que pueden ser 3, 6, 7, 10x y oculares apareados de amplio campo
visual de 10, 30 y 100x respectivamente.
Lámpara para el microscopio o luz natural
equivalente.
1.7.3.3
Procedimiento
i) Agregar 225 g de muestra a un vaso de 2
litros conteniendo aproximadamente 1 litro de agua y 50 ml de ácido clorhídrico
concentrado. Agitar bien, añadir 1ml de solución antiespumante. Calentar al
autoclave 15 min a 121ºC, dejar que la presión baje a 0 antes de abrir la
válvula de ventilación. Pasar el digerido en pequeñas porciones a través de la
malla No. 140 con agua caliente (55 - 70°C) hasta que la cantidad del residuo
permanezca constante. Colocar la malla en una charola, cubrir el residuo con
una capa de aproximadamente 2 cm de alcohol o isopropanol, dejar reposar 5 min
y drenar.
Repetir este paso 3 veces con cloroformo,
luego 2 veces más con alcohol o isopropanol y drenar completamente.
Inmediatamente transferir cuantitativamente el residuo retenido en la malla a
un vaso de
ii) Pasar completamente el contenido del vaso al
percolador o al embudo Kilborn y retener el vaso. Dejar reposar 30 min, agitar
en forma suave aproximadamente cada 5 min con un agitador largo de vidrio,
durante los primeros 20 min; drenar el contenido hasta casi 250 ml. Agregar
mezcla alcohol-ácido hasta 3 cm abajo de la parte superior y dejar reposar 30
min, agitando con la varilla como se hizo anteriormente. Drenar otra vez hasta
250 ml. Llenar el embudo con agua fría, dejar sedimentar por un tiempo
aproximado de 1,5 min y drenar hasta 250 ml. Continuar con el drenado y llenado
hasta que la fase acuosa inferior esté clara y libre de material en suspensión.
iii) Después del último lavado, drenar la
interfase agua-aceite en el vaso retenido. Inmediatamente lavar las paredes del
percolador con porciones de 50 a 100 ml de agua caliente, isopropanol o alcohol
y si fuera necesario con solución de detergente al 5%. Filtrar a través de
papel filtro rayado, lavando las paredes del vaso con porciones de 50 a 100 ml
de agua caliente, isopropanol o alcohol y si fuera necesario con solución de
detergente al 5%. Filtrar a través de papel filtro rallado, lavando las paredes
del vaso con porciones de 50 a 100 ml de agua caliente, isopropanol o alcohol y
si fuera necesario con solución de detergente al 5%, usando un gendarme de
hule. Examinar al microscopio como en el método 1.7.1
Reportar los fragmentos de insectos y pelos de
roedor, encontrados en 225 g de muestra.
2
Método para
2.1 Fundamento
Cuando un producto es sometido a secado en
condiciones específicas, presenta una pérdida de peso, debido a la evaporación
del agua que contiene, la cual se reporta como valor de humedad.
2.2 Material
Cajas de aluminio de 55 mm de diámetro por 15
mm de altura, con tapa.
Desecador hermético con agente desecante
apropiado, tales como silica gel, cloruro de calcio o equivalentes y excluyendo
el ácido sulfúrico.
Pinzas de crisol.
2.3 Equipo
Balanza analítica con sensilibidad de 0,0001 g
Estufa de secado capaz de mantenerse a 130 ±
3ºC y provista de un orificio para ventilación.
2.4 Procedimiento
2.4.1 Pesar
2.4.2 Colocar la caja con la muestra dentro de la
estufa y secar durante una hora a 130 ± 3ºC. El tiempo debe empezar a contar a
partir de que la temperatura en la estufa con la muestra alcance los 130 ± 3ºC.
La caja deberá estar semitapada.
2.4.3 Después de una hora, tapar la caja dentro de
la estufa. Sacar la caja y colocarla en el desecador y dejarla enfriar hasta
que alcance la temperatura ambiente (aproximadamente una hora).
2.4.4 Una vez que se haya enfriado pesarla y
reportar la pérdida de peso como humedad, y el residuo de la harina como
Sólidos Totales.
2.5 Cálculos
(A-B) x 100
% Humedad = -----------------------
W
% Sólidos Totales = 100 - % Humedad
En donde:
A = Peso de la caja con muestra en g
B = Peso de la caja con muestra desecada en g
W = Peso de la muestra en g
2.6 Repetibilidad
La diferencia entre dos resultados sucesivos
obtenidos en las mismas condiciones en la misma muestra no debe exceder de ±
0,2%. En caso contrario repetir las determinaciones.
2.7 Precauciones
El agente desecante debe estar en buenas
condiciones.
3 Método
de prueba para la determinación de aflatoxinas en cereales.
3.1 Preparación de
3.1.1
Pesar 25 g de muestra y
adicionarla al vaso de la licuadora.
3.1.1.1
Adicionar 5 g de cloruro de
sodio y 125 mL de metanol grado analítico al 60%.
3.1.1.2 Licuar durante un minuto a la más alta
velocidad.
3.1.1.3
Filtrar a través de papel
aflautado de 24 cm de diámetro.
3.1.2
Extracción de las AF por
medio de columnas de inmunoafinidad.
3.1.2.1
Medir 20 mL del filtrado y
adicionar 20 mL de agua destilada. Mezclar y filtrar a través de papel fibra de
vidrio.
3.1.2.2
Medir 10 o 15 mL del filtrado
(de acuerdo con las instrucciones de la columna de inmunoafinidad empleada).
3.1.2.3
Quitar la tapa de la columna
de inmunoafinidad y pasar el filtrado a través de ella a razón de un flujo de
dos gotas por segundo. Colectar en el frasco para residuos.
3.1.2.4
Lavar la columna dos veces,
con 10 mL de agua cada vez, llevando a sequedad.
3.1.2.5
En caso de haber utilizado 10
mL de filtrado, añadir 1 mL de metanol grado HPLC eluir y recibir en una celda
de borosilicato.
3.1.2.6
En caso de haber utilizado 15
mL de filtrado, añadir 2,3 mL de metanol grado HPLC eluir y recibir en una
celda de borosilicato.
3.1.2.7
Seguir con el resto de la
metodología especificada en cualquiera de los métodos de prueba establecidos en
el apartado 3 Método de prueba para la determinación de aflatoxinas en cereales
3.2 Extracción por columnas de inmunoafinidad.
3.2.1 Fundamento.
Las AF son extraídas de la muestra, con
metanol al 80%, el extracto es filtrado y diluido con agua, filtrado y pasado a
través de una columna de inmunoafinidad la cual contiene un anticuerpo
monoclonal específico para AF. En este estado la aflatoxina se liga al
anticuerpo de la columna. La columna es entonces lavada con agua para eliminar
impurezas. Posteriormente, después de pasar metanol a través de la columna, las
AF son removidas del anticuerpo, esta solución es medida en un fluorómetro
previa derivatización con solución diluida de bromo. Las AF son cuantificadas
en forma total.
3.2.2
Materiales.
Columnas de inmunoafinidad.
Papel filtro aflautado de 24 cm Ø Whatman No.
1 o equivalente.
Papel filtro fibra de vidrio de 11 cm Ø
Whatman No. 934AH o equivalente.
Matraces Erlenmeyer de 125 mL.
Vasos de precipitados de 100 mL.
Embudos de plástico de 100 mm Ø.
Embudos de plástico de 60 mm Ø.
Dosificador de 1 a 5 mL.
Dosificador de 5 a 10 mL.
Dosificador de 20 a 100 mL.
Probeta de 1000 mL.
Pipetas volumétricas de 10 mL.
Pipetas volumétricas de 5 mL.
Pipetas volumétricas de 1 mL.
Auxiliar de macropipeteado.
Jeringas de vidrio de 10 mL.
Estándares de calibración de 3 niveles.
Celdas de borosilicato de 12x75 mm.
Gradilla de plástico para celdas de 12x75 mm.
Preparación de patrones de calibración. De no
contar con los estándares provistos por el fabricante, preparar el estándar de
calibración de la siguiente manera: use como testigo ácido sulfúrico (H2SO4)
0.1N. Como patrón de AF de 20 ng, use 34 mg de sulfato de quinina
dihidratada/mL de H2SO4 0.1N.
3.2.3 Equipo.
Licuadora de alta velocidad con vaso de acero
inoxidable o de vidrio de 250 mL.
Bomba manual.
Mezclador tipo vórtex.
Fluorómetro con lámpara pulsada de Xenón o
cuarzo-halógeno y filtros de excitación de 360 nm y de emisión de 450 nm.
3.2.4 Reactivos.
Solución de metanol al 80%.
Medir 800 mL de metanol grado analítico y
mezclar con 200 mL de agua destilada en probeta graduada de 1000 mL.
Cloruro de sodio.
Metanol grado HPLC.
Solución reveladora de bromo al 0,03%.
i) Solución de bromo al 0,03%.
ii) Se mide 1 mL de solución reveladora de
concentración al 0,03% y se añaden 9 mL de agua destilada. Preparar el día de
su uso.
Solución PBS pH 7.3 *.
* En caso que se requiera por parte del
fabricante de la columna.
i) Preparación PBS pH 7.3. En caso de ser
necesaria la preparación de la solución se tienen las siguientes alternativas:
a) Pesar las siguientes sales:
Cloruro de potasio 1 g.
Ortofosfato dihidrogenado de potasio 1 g.
Ortofosfato hidrogenado de sodio (anhidro) 5,8
g.
Cloruro de sodio 40,0 g.
Disolver las sales en aproximadamente 4,5
litros de agua destilada.
Ajustar el pH de la solución a 7.3 utilizando
ácido clorhídrico (HCI) o hidróxido de sodio (NaOH), según corresponda.
Completar el volumen final a 5 litros y volver
a verificar el pH.
b) Tomar una tableta de PBS y disolver en 100 mL de agua destilada.
Las
soluciones permanecen estables durante un mes.
3.2.5 Preparación de la muestra analítica.
3.2.5.1 Pesar 50 g de la muestra molida e
introducirla en el vaso de la licuadora.
3.2.5.2
Adicionar 5 g de cloruro de
sodio y 100 mL de metanol al 80%.
3.2.5.3
Licuar durante un minuto a
alta velocidad.
3.2.5.4 Filtrar a través de
papel aflautado de 24 cm de Ø. (Filtrado 1).
3.2.6 Extracción de las AF por medio de columnas de
inmunoafinidad.
3.2.6.1 Medir 10 mL del filtrado 1 y adicionar 40 mL
de agua destilada. Mezclar y filtrar a través de papel fibra de vidrio
(filtrado 2).
3.2.6.2
Medir 5 mL del filtrado 1 y
adicionar 35 mL de agua destilada. Mezclar y filtrar a través de papel fibra de
vidrio (filtrado 2).
3.2.6.3
Conectar una columna de
inmunoafinidad a la punta de una jeringa de vidrio colocada en la bomba manual.
En caso de ser necesario pasar a través de la columna 20 mL de PBS.
3.2.6.4
En el caso de seguir el
procedimiento descrito en el punto anterior 3.2.6.1, medir 10 mL filtrado 2 en
la jeringa.
3.2.6.5
En el caso de seguir el
procedimiento descrito en el punto anterior 3.2.6.2, medir 15 mL del filtrado 2
en la jeringa.
3.2.6.6 Quitar la tapa de la columna de
inmunoafinidad y pasar el filtrado 2
a través de ella a razón de un flujo de dos gotas por segundo. Colectar en el
frasco para residuos.
3.2.6.7 Lavar la columna dos veces, con 10 mL de agua
cada vez.
3.2.6.8
Pasar aire por la columna
llevándola a sequedad.
3.2.6.9
En caso de seguir el
procedimiento descrito en el punto 3.2.6.4, añadir 1 mL de metanol grado HPLC,
eluir y recibir en una celda de borosilicato.
3.2.6.10 En caso de seguir el procedimiento descrito
en 3.2.6.5, añadir 2,3 mL de metanol
grado HPLC, eluir y recibir en una celda de borosilicato.
3.3 Cuantificación por fluorometría.
3.3.1
Calibración de los
fluorómetros.
La calibración del fluorómetro debe hacerse de
acuerdo con la que señale el "Manual del fabricante".
3.3.2
Procedimiento de
cuantificación.
3.3.2.1 Una vez separadas las AF de conformidad con
lo señalado en el punto anterior extracción de
3.3.2.2
Adicionar solución reveladora
1 mL (si se siguió el punto 3.2.6.1). o 2 mL (si se siguió el punto anterior
3.2.6.2).
3.3.2.3
Agitar la celda en el
agitador tipo vórtex (eliminar las burbujas que se forman).
3.3.2.4 Colocar la celda en el fluorómetro
previamente calibrado.
3.3.2.5
Leer la concentración de AF
totales después de 60 segundos, directamente en µg/kg.
3.4 Método HPLC.
3.4.1
Fundamento.
Las AF son extraídas de la muestra, con
metanol al 80%, el extracto es filtrado, diluido con agua y pasado a través de
una columna de inmunoafinidad la cual contiene un anticuerpo monoclonal
específico para AF B1, B2, G1 y G2. Las AF son aisladas, purificadas y
concentradas en la columna y posteriormente son eluidas con acetonitrilo. El
eluido es derivatizado con ácido trifluoroacético. Las AF son cuantificadas en
forma individual por cromatografía en fase reversa y detectadas por
fluorometría.
3.4.2 Materiales.
Columnas de inmunoafinidad.
Papel filtro aflautado de 24 cm Ø.
Papel filtro fibra de vidrio de 11 cm Ø.
Matraces Erlenmeyer de 125 mL.
Vasos precipitados de 100 mL.
Embudos de plástico de 100 mm Ø.
Embudos de plástico de 60 mm Ø.
Dosificador de 1 a 5 mL.
Dosificador de 10 a 50 m.
Micropipetas digitales de 10 a 100 µL; 100 a
1000 µL.
Filtros para solventes orgánicos de 47 mm y
poro de 0,45 µm.
Filtros para solventes acuosos de 47 mm y poro
de 0,45 µm.
Equipo de filtración Millipore o similar.
Dosificador de 20 a 100 mL.
Probeta de 1000 mL.
Pipetas volumétricas de 10 mL.
Pipetas volumétricas de 5 mL.
Pipetas volumétricas de 1 mL.
Auxiliar de macropipeteado.
Jeringas de vidrio de 10 mL.
Probeta graduada de 100 mL.
Frascos vial de vidrio ámbar con tapón de
rosca capacidad de 4 mL.
Frascos de vidrio de 1 litro para
almacenamiento de fase móvil.
Viales de vidrio ámbar de 1,8 mL con septum de
rosca.
Filtros para muestras de politetrafluoretileno
de 13 mm y poro de 0,45 µm.
Matraces aforados color ámbar de 50 y 100 mL.
Matraces volumétricos de 1 y 2 L.
Jeringas desechables de 5 mL con aguja.
Frascos color ámbar de 100 mL con tapón.
Celdas de cuarzo para espectrofotómetro de 1
cm de paso de luz.
Pipetas Pasteur.
Pipetas volumétricas de
25 mL.
3.4.3
Equipo.
Sistema de degasificación de solventes por
membrana de vacío, inyección de helio u otro equivalente.
Bombas de gradiente con válvula para mezclado
de cuatro solventes o sistema isocrático de bombas.
Inyector automático o manual de muestras con
loop de 50 µL o más y sistema de autolimpieza.
Columna HPLC C-18 de 4,6 x 250 mm o 4,6 x 150
mm, 5 µm de tamaño partícula.
Detector de fluorescencia con lámpara pulsada
de Xenón y filtros de excitación a 360 nm y de emisión de 450 nm.
Graficador, integrador de datos o computadora
personal con el software adecuado para el control del equipo y procesamiento de
datos.
Balanza granataria con una precisión de 0,1 g.
Baño de agua con temperatura controlada 65°C.
Molino para granos.
Licuadora a alta velocidad con jarra de acero
inoxidable de 250 mL.
Espectrofotómetro de Ultravioleta - visible
capaz de hacer barrido de 330 a 370 nm.
3.4.4 Preparación de reactivos.
Agua grado HPLC filtrada a través de poro de
0,45µm.
Acetonitrilo grado HPLC filtrado a través de
poro de 0,45µm.
Metanol grado HPLC filtrado a través de poro
de 0,45µm.
Fase móvil: agua 60%, acetonitrilo 20%,
metanol 20%, para columna de 4,6 x 250 mm y agua 70%, acetonitrilo 12% y
metanol 18% para columna de 4,6 x 150 mm. Las proporciones de la fase móvil
pueden ajustarse a fin de obtener una buena resolución de las AF.
Acido trifluoroacético.
Agua destilada.
Acido acético glacial.
Solución derivatizadora.
Mezclar 10 mL de ácido trifluoroacético, 5 mL
de ácido acético glacial y 35 mL de agua destilada. Filtrar a través de poro de
0,45µm.
Benceno grado espectrométrico.
Acetonitrilo grado espectrométrico.
Patrones individuales certificados de AFB1,
B2, G1 y G2 en cristales o películas.
Mezcla de benceno-acetonitrilo (98+2).
Medir 98 mL de benceno y mezclar con 2 mL de
acetonitrilo. Guardar en frasco color ámbar bien tapado.
Acido sulfúrico concentrado.
Dicromato de potasio.
Solución de ácido sulfúrico 0,018 N.
Disolver 1 mL de ácido sulfúrico concentrado y
aforar a 2 L con agua.
Soluciones patrón de dicromato de potasio.
Aproximadamente 0,25 mM. Pesar exactamente 78
mg de dicromato de potasio previamente secado en estufa a 100 105° C durante
2 h, y aforar a 1 L con ácido sulfúrico 0,018 M.
i) Aproximadamente 0,125 mM. Diluir 25 mL de la solución de
0,25 mM a 50 mL con ácido sulfúrico 0,018 M.
ii) Aproximadamente 0,0625 mM. Diluir 25 mL de la
solución de 0,125 mM a 50 mL con ácido sulfúrico 0,018 M.
3.4.5 Preparación de soluciones patrón de AF.
3.4.5.1 Inyectar con
jeringa desechable y sin abrir los frascos que contienen la aflatoxina,
aproximadamente 4 mL de mezcla de benceno: acetonitrilo 98+2. Agitar en
mezclador vórtex hasta completar disolución.
3.4.5.2 Abrir con mucho cuidado cada uno de los
frascos y, trasvasar analíticamente a un matraz aforado de 100 mL. Aforar con
mezcla de benceno: acetonitrilo (concentración aproximada de 100 µg/mL).
3.4.5.3 Medir exactamente 10 mL de esta solución y
aforar a 100 mL con benceno: acetonitrilo 98+2 (concentración aproximada de 10
µg/mL).
3.4.5.4
Trasvasar las soluciones
anteriores a un frasco color ámbar con tapón y debidamente identificado, y
guardar en congelación hasta su uso.
3.4.6 Obtención del espectro de absorción.
3.4.6.1
Dejar equilibrar a
temperatura ambiente cada una de las soluciones estándar de aproximadamente 10
µg/mL.
3.4.6.2
Calibrar el espectrofotómetro
a 0 de absorbancia utilizando una solución de benceno: acetonitrilo 98+2 como
blanco.
3.4.6.3 Efectuar un barrido de 330 a 370 nm de cada
una de las soluciones y obtener el valor de absorbancia a la longitud de máxima
absorción, la cual debe estar cercana a 350 nm.
|
Aflatoxina |
Absorbancia máxima (A) |
Peso molecular (PM) |
Coeficiente de extinción (CE) |
|
B1 |
|
312 |
19,800 |
|
B2 |
|
314 |
20,900 |
|
G1 |
|
328 |
17,100 |
|
G2 |
|
330 |
18,200 |
3.4.6.4
Regresar las soluciones de
cada una de las AF a su frasco original.
3.4.6.5
Cálculo de la concentración.
µg AF/mL = A x PM x
1000 x FC CE
donde:
FC = Factor de corrección (confrontar
instrucciones para el cálculo de factor de corrección).
Cada una de las soluciones debe presentar una
concentración entre 8 y 10 µg/mL.
3.4.7 Cálculo del factor de corrección (FC).
3.4.7.1 Calibrar el espectrómetro a 0 de absorbancia
utilizando ácido sulfúrico 0,018 N como blanco.
3.4.7.2 Leer la absorbancia de las tres soluciones de
dicromato de potasio de menor a mayor concentración, a la longitud de onda de
máxima absorción, la cual debe ser cercana a 350 nm.
3.4.7.3 Llenar la siguiente tabla con los valores de absorbancia obtenidos y
los cálculos realizados:
|
Sol. Dicromato de potasio (mM) |
Absorbancia a 350 nm (A) |
CE= A x 1000/mM |
|
0,25 |
|
|
|
0,125 |
|
|
|
0,0625 |
|
|
|
|
|
CE promedio = |
3.4.7.4 Calcular el factor de corrección (FC)
aplicando la siguiente ecuación:
donde:
3160 es el coeficiente de extinción (CE) para
soluciones de dicromato de potasio.
El valor de FC debe estar en el intervalo de
0,95 a 1,05, de no ser así verificar el instrumento o la técnica para
determinar y eliminar la causa.
3.4.8 Preparación de la solución madre de AF de
1000 ng/ml.
De las soluciones madre de AF individuales y
de concentración conocida (10 µg/mL), medir las cantidades en microlitros que
correspondan a 500 ng de B1, 300 ng de B2,
100 ng de G1 y 100 ng de G2 para preparar 50 mL de la misma. Aforar a 50
ml con solución de benceno: acetonitrilo (98+2) y agitar. Guardar en frasco
vial de vidrio color ámbar perfectamente identificado y en congelación. Cada µl
de solución equivale a un ng de AF totales.
3.4.9 Preparación de las soluciones patrón de
trabajo.
Medir 20, 50, 100, 150 y 200 µL de la solución
madre (1000 ng/ml) en viales de vidrio ámbar. Evaporar a sequedad con nitrógeno. Añadir 1 mL de
acetonitrilo grado HPLC. Agitar y guardar en congelación hasta su uso.
3.4.10 Curva estándar de AF en ng/mL.
|
AF |
B1 |
B2 |
G1 |
G2 |
Totales |
|
Conc. 1 |
10 |
2 |
6 |
2 |
20 |
|
Conc. 2 |
25 |
5 |
15 |
5 |
50 |
|
Conc. 3 |
50 |
10 |
30 |
10 |
100 |
|
Conc. 4 |
75 |
15 |
45 |
15 |
150 |
|
Conc. 5 |
100 |
20 |
60 |
20 |
200 |
3.4.11 Preparación de las muestras.
Una vez separadas las AF de conformidad con lo
señalado en el punto 3.2.6, proceder con los siguientes pasos:
3.4.11.1
Añadir acetonitrilo 1 ml (si
se siguió el procedimiento descrito en el punto 3.2.6.1) o 1,5 ml (si se siguió
el procedimiento descrito en el punto 3.2.6.2).
3.4.11.2
Eluir y colectar en un frasco
vial color ámbar. Guardar en congelación hasta su uso.
3.4.12 Derivatización de las AF B1 y
G2.
3.4.12.1
Sacar del congelador las
mezclas patrón de trabajo y las muestras preparadas. Llevar a temperatura
ambiente.
3.4.12.2
Medir 200 µl de cada una de
ellas y adicionar 700 µL de solución derivatizadora, todo en un frasco vial de
1,8 mL. Mezclar por 30 seg.
3.4.12.3 Incubar a 65°C durante 10 min en baño de
agua.
3.4.12.4
Enfriar al chorro de agua.
Filtrar a través de filtro para muestras de 0,45 ml.
3.4.12.5 Guardar en congelación hasta su uso.
3.4.13 Acondicionamiento del cromatógrafo de
líquidos.
3.4.13.1
Encender todos los
componentes del sistema de cromatografía.
3.4.13.2
Fijar los siguientes
parámetros cromatográficos de acuerdo con las instrucciones de operación del equipo:
Fase móvil:
Para columna de 4,6 x 250 mm: agua 60%,
acetonitrilo 20%, metanol 20%.
Para columna de 4,6 x 150 mm: agua 70%,
acetonitrilo 12%, metanol 18%.
Flujo: 1 mL/min.
Volumen de inyección: 50 µl.
Tiempo de análisis: 15 min.
Detector de fluorescencia:
Excitación: 360 nm.
Emisión: 440 nm.
3.4.13.3
Ajustar la atenuación y el
factor de respuesta del detector a fin de obtener una sensibilidad óptima.
3.4.13.4 Purgar las
bombas del sistema con cada uno de los componentes de la fase móvil usando un
flujo de 10 mL/min. Colectar aproximadamente 20 ml.
3.4.13.5 Correr la fase móvil a través de todo el sistema a un flujo de 1 mL/min,
hasta obtener una línea base estable (aproximadamente 30 min).
3.4.14 Acondicionamiento del método.
3.4.14.1 Inyectar 50 µl de la mezcla estándar de trabajo derivatizada equivalente
a 100 ng/ml de AF totales.
3.4.14.2 Verificar una buena resolución de las 4 AF así como optimizar el tiempo
de corrida (aproximadamente 15 min). Las AF eluyen en el siguiente orden: G1,
B1, G2 y B2. Considerar el tiempo de retención de cada
aflatoxina.
3.4.14.3 Inyectar por triplicado 50 ml de cada una de las cinco mezclas patrón de
trabajo.
3.4.14.4 Obtener e imprimir el cromatograma de cada una de ellas.
3.4.14.5 Graficar la concentración de cada aflatoxina contra el área promedio
del pico obtenida. Calcular mediante regresión lineal la pendiente, el factor
de correlación y la ordenada al origen de cada uno de los gráficos.
1. ml solución madre
de 1000 ng/ml totales.
2. Cantidad de AFG1 en ng.
3. Area promedio de pico de AFG1 en ng.
4. Cantidad de AFB1 en ng.
5. Area promedio de pico de AFB1 en ng.
6. Cantidad de AFG2 en ng.
7. Area promedio de pico de AFG2 en ng.
8. Cantidad de AFB2 en ng.
9. Area promedio de pico de AFB2 en ng.
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
|
20 |
6 |
|
10 |
|
2 |
|
2 |
|
|
50 |
15 |
|
25 |
|
5 |
|
5 |
|
|
100 |
30 |
|
50 |
|
10 |
|
10 |
|
|
150 |
45 |
|
75 |
|
15 |
|
15 |
|
|
200 |
60 |
|
100 |
|
20 |
|
20 |
|
3.4.15 Inyección de muestras.
3.4.15.1 Inyectar 50 ml de cada una de las muestras derivatizadas.
3.4.15.2 Obtener e imprimir el cromatograma de cada una de ellas.
3.4.15.3 Identificar cada una de las AF comparando el tiempo de retención contra
el obtenido para cada uno de los patrones.
3.4.15.4 Obtener el valor del área de cada AF en la muestra.
3.4.16 Expresión de resultados.
mg/kg de AF en la muestra = Area de pico -
ordenada al origen x 1 o 1,5 x dilución
pendiente
Se utilizará 1 o 1,5
dependiendo de la cantidad de acetonitrilo que se agregó al eluato.
El resultado será la suma de
los valores de las distintas AF.
3.4.17 Limpieza del
sistema de cromatografía.
3.4.17.1 Al terminar
los análisis, apagar el detector y el inyector automáticos.
3.4.17.2 Bombear
acetonitrilo o metanol por espacio de media hora.
3.4.17.3 Posteriormente
apagar el sistema de bombas y la computadora.
3.4.18 Del
procedimiento de limpieza y descontaminación del material de vidrio y área de
trabajo para la determinación de aflatoxinas.
3.4.18.1 Objetivo.
Establecer directrices para la
descontaminación del material, equipo y área de trabajo utilizados, así como
los procedimientos a seguir en caso de derrames y remanentes de extractos de
las muestras.
3.4.18.2
Generalidades.
El trabajo de limpieza y
descontaminación será realizado por personal capacitado y que cuente con equipo
protector como bata, guantes impermeables y lentes de seguridad.
3.4.18.3 Descontaminación
del material de laboratorio.
Todo el material de vidrio que
haya sido utilizado durante el análisis, debe sumergirse en una solución de hipoclorito
de sodio, la cual se prepara diluyendo una parte de solución comercial de
hipoclorito (con una concentración entre 5 y 6%), con diez partes de agua.
Después del tratamiento, el
material debe enjuagarse abundantemente con agua corriente, seguido de agua
destilada, y secar por escurrimiento o en estufa de 90-100°C.
3.4.18.4
Descontaminación del área de trabajo.
Después del análisis, las
superficies de las áreas de trabajo deben limpiarse con una toalla desechable
impregnada en solución de hipoclorito de sodio.
3.4.18.5
Descontaminación de material desechable.
Todo el material desechable,
debe sumergirse durante un mínimo de 5 min en la solución de hipoclorito de
sodio. La solución descontaminante usada debe eliminarse por el drenaje y los
materiales desechables tratados, deben empacarse en una bolsa de plástico
sellada para colocarse en el depósito de desechos.
3.4.18.6 Tratamiento
de derrames.
Los derrames de soluciones de
AF deben tratarse inmediatamente con hipoclorito de sodio, vertiéndolo directamente
del envase, recoger los líquidos con un papel absorbente, el cual también se
colocará en una bolsa de plástico.
3.4.18.7 Tratamiento
de remanentes de extracto de muestras.
Una vez que se ha separado una
alícuota del extracto de la muestra es frecuente que permanezca un remanente
del mismo. Estos restos de extractos deben tratarse con una cantidad de
hipoclorito de sodio equivalente a la unidad de volumen del residuo a tratar.
Los líquidos resultantes se deben acumular en un recipiente para desechos líquidos
y eliminarse en un lugar destinado especialmente para éstos.
4 Análisis microbiológico de productos objeto de esta norma
4.1 Procedimiento para
la preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis
microbiológico.
4.1.1 Introducción
Esta norma está orientada a
proporcionar las guías generales para la preparación de diluciones para el
examen microbiológico de alimentos. En vista de la gran cantidad de productos
en este campo de aplicación, estas guías pueden ser inapropiadas para todos ellos
en forma detallada y para otros requerirse otros métodos diferentes. Sin
embargo, en todos los casos donde sea posible se recomienda apegarse a estas
guías y modificarse únicamente cuando sea necesario.
La dilución primaria tiene por
objeto obtener una distribución lo más uniforme posible de los microorganismos
contenidos en la muestra destinada para el análisis.
La preparación de diluciones
decimales adicionales, si son necesarias, tiene como objetivo reducir el número
de microorganismos por unidad de volumen, para permitir, después de la
incubación, la observación de la prueba en el caso de tubos o matraces y la
cuenta de colonias en el caso de placas.
4.1.2 Reactivos y
materiales
4.1.2.1 Reactivos
Los reactivos que a
continuación se mencionan deben ser grado analítico. Cuando se indique agua
debe entenderse como agua destilada.
Preparación de reactivos
Solución de hidróxido de sodio 1,0 N
|
FORMULA |
|
|
INGREDIENTES |
CANTIDADES |
|
Hidróxido
de sodio |
4,0 g |
|
Agua |
100 ml |
Preparación:
Disolver el hidróxido de sodio
y llevar a 100 ml con agua.
Soluciones diluyentes
Solución reguladora de fosfatos
(solución concentrada).
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Fosfato de sodio monobásico |
34,0 g |
|
Agua |
1,0 l |
Preparación:
Disolver el fosfato en 500 ml
de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1,0 N.
Llevar a un litro con agua.
Esterilizar durante 15 minutos
a 121° ± 1,0°C.
Conservar en refrigeración
(solución concentrada).
Tomar 1,25 ml de la solución
concentrada y llevar a un litro con agua (solución de trabajo).
Distribuir en porciones de 99,90
y 9 ml según se requiera.
Esterilizar a 121° ± 1,0°C
durante 15 minutos.
Después de la esterilización,
el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales a
los iniciales.
Agua peptonada
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Peptona |
1,0 g |
|
Cloruro
de sodio |
8,5 g |
|
Agua |
1,0 l |
Preparación:
Disolver los componentes en un
litro de agua.
Ajustar el pH a 7 ± 0,1 con
hidróxido de sodio 1,0 N.
Distribuir en porciones de
99,90 y 9 ml o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera.
Esterilizar a 121 ± 1,0°C
durante 15 minutos.
Después de la esterilización,
el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales a
los iniciales.
Si este diluyente no es
usado inmediatamente, almacenar en lugar oscuro a una temperatura entre 0 a 5°C
por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su
volumen o composición.
4.1.2.2 Materiales
Pipetas bacteriológicas
para distribuir 10 y 1 ml (o si es necesario de 1 ml y 2 ml), con tapón de
algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de
su volumen total.
Frascos de vidrio de 250 ml con
tapón de rosca.
Tubos de 16 x 150 mm con tapón
de rosca.
Utensilios esterilizables para
la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas, etc.
Todo el material e instrumentos
que tengan contacto con las muestras bajo estudio deberán esterilizarse
mediante:
Horno, durante 2 h a
El material de vidrio puede
sustituirse por material desechable que cumpla con las especificaciones
deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por esterilización repetida
y éste debe ser químicamente inerte.
4.1.3 Aparatos e
instrumentos
Horno para esterilizar que
alcance una temperatura mínima de 170°C.
Autoclave con termómetro y
manómetro, calibrada con termómetro de máximas y mínimas.
Baño de agua con control de
temperatura y circulación mecánica, provista con termómetro calibrado con
divisiones de 0,1°C y que mantenga la temperatura a 45 ± 0,5°C.
Licuadora de una o dos
velocidades controladas por un reóstato o bien un homogeneizador peristáltico
(Stomacher).
Vasos para licuadora con tapa
esterilizables o bolsas estériles para homogeneizador peristáltico.
Balanza granataria con
sensibilidad de 0,1 g.
4.1.4 Procedimiento
4.1.4.1 Preparación de
la dilución primaria.
Para muestras congeladas de un
alimento originalmente líquido o licuable, fundir por completo en baño de agua
de 40 a 45°C un tiempo máximo de 15 minutos y homogeneizar agitando
vigorosamente.
Para la parte líquida de una
muestra heterogénea la cual sea considerada suficientemente representativa de
la muestra total (por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales).
i) Agitar la muestra
manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm efectuados
en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 ml de la muestra y diluir con 9 ml del
diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura similar a ésta, evitando
el contacto entre la pipeta y el diluyente.
ii) Siempre que la
cantidad de muestra lo permita, tomar alícuotas mayores, por ejemplo volúmenes
de 10 u 11 ml, diluidos con 90 o 99 ml, de la misma forma que se describió
anteriormente
4.1.4.2 A partir de
muestras sólidas o semisólidas.
Las muestras sólidas y
semisólidas congeladas, deben descongelarse en refrigeración de 4 a 8ºC durante
18 horas y no más de 24 horas antes de proceder a su análisis.
i) Pesar una cantidad
de 10 u 11 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa plástica
estériles de tamaño adecuado.
ii) Adicionar un
volumen de 90 a 99 ml del diluyente llevado a una temperatura similar a la de
la muestra.
iii) Operar la
licuadora o el homogeneizador peristáltico de 1 a 2 minutos hasta obtener una
suspensión completa y homogénea según se indique en la técnica correspondiente
para cada alimento. Aún en los equipos más lentos, este tiempo no debe exceder
de 2,5 minutos.
iv) Permitir que las
partículas grandes se sedimenten, y transferir la cantidad deseada tomando de
las capas superiores de la suspensión.
Cuando la dilución primaria es
muy viscosa o pegajosa, adicionar más diluyente, lo cual debe tomarse en cuenta
para las operaciones subsecuentes o expresión de resultados. El homogeneizador
peristáltico (Stomacher) puede no ser adecuado para algunos productos (por
ejemplo, aquellos con partículas agudas o
constituyentes que no se dispersen fácilmente). Debe ser utilizado sólo cuando
exista evidencia (publicada o por ensayos comparativos) de que los resultados
obtenidos no difieren significativamente con aquellos obtenidos con licuadora.
4.1.4.2 Preparación de
las diluciones decimales adicionales.
i) Transferir 1 ml o
un múltiplo, por ejemplo, 10 u 11 ml de la dilución primaria 1 + 9 (10-1), en
otro recipiente conteniendo nueve veces el volumen del diluyente estéril a la
temperatura apropiada, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente.
ii) Mezclar cuidadosamente cada botella de
diluyente siempre de la misma manera que se describe en el punto i) del numeral
4.1.4.1
iii) La selección de las diluciones que se vayan a
preparar y de aquellas que se van a inocular, dependen del número esperado de
microorganismos en la muestra, con base a los resultados de análisis previos y
de la información que se obtenga del personal de inspección que la haya
colectado. En ausencia total de información, trabajar con las diluciones de la
primera a la sexta.
iv) Utilizar pipetas diferentes para cada
dilución inoculando simultáneamente las cajas que se hayan seleccionado. El
volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de
la pipeta.
v) Si la pipeta es terminal y se transfiere un
volumen de líquido equivalente a su capacidad total, escurrir aplicando la
punta de la pipeta una sola vez en una área de la caja Petri sin líquido.
vi) Mientras se afora el líquido de la pipeta, la
punta de ésta debe apoyarse en el interior del cuello del frasco y mantenerla
en posición vertical, para lo cual este último debe inclinarse lo necesario.
En estudios donde se busca la presencia o
ausencia de una determinada especie de microorganismos en 0,1 ml o 0,1 g, no es
necesario preparar diluciones mayores.
El criterio para seleccionar las diluciones a
preparar de acuerdo con el número de microorganismos esperado es:
Para la técnica del número más probable
utilizar tres tubos: donde sea posible demostrar el microorganismo en 10 ml de
la dilución más alta.
Para la técnica de cuenta en placa, considerar
aquellas en las que se puedan contar de 25 a 250 colonias en un mínimo de una
de tres diluciones en el método de cuenta de bacterias aerobias en placa. En el
caso de otros grupos microbianos, considerar el número especificado de colonias
en
4.1.4.3 Duración del procedimiento.
En general, las diluciones de la muestra deben
ser preparadas inmediatamente antes del análisis y éstas deben ser usadas para
inocular el medio de cultivo dentro de los 20 minutos posteriores a su
preparación.
4.2 Metodo para la cuenta de bacterias aerobias en
placa.
4.2.1
Introducción
Cuando se requiere investigar el contenido de
microorganismos viables en un alimento, la técnica comúnmente utilizada es la
cuenta en placa. En realidad esta técnica no pretende poner en evidencia todos
los microorganismos presentes. La variedad de especies y tipos diferenciables
por sus necesidades nutricionales, temperatura requerida para su crecimiento,
oxígeno disponible, etc., hacen que el número de colonias contadas constituyan
una estimación de la cifra realmente presente y la misma refleja si el manejo
sanitario del producto ha sido el adecuado.
Por otra parte el recuento de termofílicos,
psicrofílicos y psicotróficos es importante para predecir la estabilidad del
producto bajo diferentes condiciones de almacenamiento.
Para obtener resultados reproducibles y por lo
tanto significativos, es de suma importancia seguir fielmente y controlar
cuidadosamente las condiciones.
Esta técnica puede aplicarse para la
estimación de microorganismos viables en una amplia variedad de alimentos.
4.2.2
Fundamento
El fundamento de la técnica consiste en contar
las colonias, que se desarrollan en el medio de elección después de un cierto
tiempo y temperatura de incubación, presuponiendo que cada colonia proviene de
un microorganismo de la muestra bajo estudio. El método admite numerosas
fuentes de variación, algunas de ellas controlables, pero sujetas a la
influencia de varios factores.
4.2.3
Reactivos y materiales
4.2.3.1
Reactivos
Los reactivos que a continuación se mencionan,
deben ser grado analítico.
Cuando se indique agua, debe entenderse agua
destilada, con pH cercano a la neutralidad.
Medio de Cultivo.
Agar Triptona-Extracto de Levadura (agar para
cuenta estándar).
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Extracto
de levadura |
2,5
g |
|
Triptona |
5,0
g |
|
Dextrosa |
1,0
g |
|
Agar |
15,0
g |
|
Agua |
1,0
l |
Preparación del medio de cultivo.
Suspender los componentes del medio
deshidratado en un litro de agua. Hervir hasta total disolución.
Distribuir en recipientes de vidrio
esterilizables de capacidad no mayor de 500 ml, cantidades de aproximadamente
la mitad del volumen del mismo. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1,0 ºC,
durante 15 minutos. El pH final del medio debe ser 7,0 ± 0,2 a 25ºC.
Si el medio de cultivo es utilizado
inmediatamente, enfriar a 45ºC ± 1,0 ºC en baño de agua y mantenerlo a esta
temperatura hasta antes de su uso. El medio no debe de fundirse más de una vez.
En caso de medios deshidratados seguir las
instrucciones del fabricante.
El medio de cultivo anterior es el de uso más
generalizado. Para algunos alimentos en particular se requerirá de un medio de
cultivo especial que se debe indicar al describir la técnica para ese alimento.
4.2.3.2
Materiales
Todo el material que tenga contacto con las
muestras o los microorganismos debe estar estéril.
Se requiere, los materiales mencionados en 4.1
Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis
Microbiológico.
4.2.4
Aparatos e instrumentos
Se requiere, además de los mencionados en 4.1,
Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis
microbiológico, los siguientes:
Incubadora con termostato que evite
variaciones mayores de ± 1,0 ºC, provista con termómetro calibrado.
Contador de colonias de campo obscuro, con luz
adecuada, placa de cristal cuadrículada y lente amplificador.
Registrador mecánico o electrónico.
Microscopio óptico.
Baño de agua con o sin circulación mecánica,
provista con termómetro calibrado con divisiones de hasta 1,0°C y que mantenga
la temperatura a 45 ± 1,0°C.
4.2.5
Preparacion de la muestra
Para la preparación de la muestra seguir la
4.1, Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis
microbiológico.
4.2.6
Procedimiento
4.2.6.1
Distribuir las cajas
estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación; la adición de
medio de cultivo y homogenización, se puedan realizar cómoda y libremente.
Marcar las cajas en sus tapas con los datos pertinentes previamente a su
inoculación y correr por duplicado.
4.2.6.2
Después de inocular las
diluciones de las muestras preparadas según en B.5.1 Preparación y dilución de
muestras de alimentos para su análisis microbiológico, en las cajas Petri,
agregar de 12 a 15 ml del medio preparado, mezclarlo mediante 6 movimientos de
derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido
contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta
lograr una completa incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el medio
no moje la cubierta de las cajas. Dejar solidificar.
4.2.6.3
Incluir una caja sin inóculo
por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de esterilidad.
4.2.6.4
El tiempo transcurrido desde
el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se
adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.
4.2.6.5 Incubar las
cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la
temperatura que se requieran, según el tipo de alimento y microorganismo de que
se trate, véase el cuadro 1.
CUADRO
1
|
Grupo
bacteriano |
Temperatura |
Tiempo
de incubación |
|
Termofílicos
aerobios |
55 ± 2ºC
|
48 ± 2 h |
|
Mesofílicos
aerobios |
35 ± 2ºC
|
48 ± 2 h |
|
Psicrotróficos |
20 ± 2ºC
|
3 - 5
días |
|
Psicrofílicos
|
5 ± 2ºC |
7 - 10
días |
4.2.6.6 En la lectura
seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 25 a 250 UFC, para disminuir
el error en la cuenta.
4.2.6.7 Contar todas
las colonias desarrolladas en las placas seleccionadas (excepto las de mohos y
levaduras), incluyendo las colonias puntiformes. Hacer uso del microscopio para
resolver los casos en los que no se pueden distinguir las colonias de las
pequeñas partículas de alimento.
4.2.7 Expresión de
resultados
4.2.7.1 Cálculo del
método.
i) Después de la
incubación, contar las placas que se encuentren en el intervalo de
ii) Cuando dos
diluciones están en el intervalo apropiado, determinar la cuenta promedio dada
por cada dilución antes de promediar la cuenta de las dos diluciones para
obtener la cuenta en placa por gramo o mililitro, véase el cuadro 2, ejemplo 2.
iii) Con el fin de
uniformar los criterios para el reporte de las cuentas en ensayos donde las
placas presenten situaciones no contempladas en los ejemplos anteriores, se
presentan las siguientes guías:
iv) Placas con menos
de 25 colonias.- Cuando las placas corridas para la menor dilución muestran
cuentas de menos de 25 colonias, contar el número de colonias presentes en
dicha dilución, promediar el número de colonias y multiplicar por el factor de
dilución para obtener el valor estimado de cuenta en placa. Aclarar en su
informe esta situación agregando la leyenda "valor estimado", véase
el cuadro 2, ejemplo 3.
v) Placas con más de
250 colonias.- Cuando el número de colonias por placa exceda de 250, contar las
colonias en aquellas porciones de la placa que sean representativas de la
distribución de colonias. Contar por ejemplo, una cuarta parte o una mitad del
área de la caja y multiplicar el valor obtenido por 4 o 2, respectivamente. Si
solamente pueden contarse algunos cuadros, considerar que el fondo de una caja
Petri de 100 mm de diámetro contiene 65 cuadros de la cuadrícula del contador.
Aclarar en el informe esta situación agregando la leyenda "valor
estimado", véase el cuadro 2, ejemplo 4.
vi) Colonias
extendidas.- Las colonias extendidas pueden presentarse en las siguientes
formas:
vii) Cadenas de
colonias no separadas claramente entre sí, que parecen ser causadas por la
desintegración de un cúmulo de bacterias.
viii) Colonias que se
desarrollan en película entre el agar y el fondo de la caja.
ix) Colonias que se
desarrollan en película en la orilla de la caja sobre la superficie del agar.
x) Colonias de
crecimiento extendido y en algunas ocasiones acompañadas de inhibición del
crecimiento, que en conjunto exceden el 50% de la caja o represión del
crecimiento que por sí mismo excede el 25% de la superficie de la caja.
xi) Cuando es
necesario contar en cajas que contienen colonias extendidas que no están
incluidas en punto x) del numeral 4.2.7.1, contar cualquiera de los tipos vii),
viii) o ix) del numeral 4.2.7.1, como provenientes de una sola fuente. En el
caso de las colonias del tipo vii) del numeral 4.2.7.1, si la caja contiene una
sola cadena, contar como una sola colonia, si la caja contiene varias cadenas
que parecen originarse de fuentes separadas, contar cada cadena como colonia
individual. No contar cada colonia de la cadena individualmente. Las colonias
del tipo vii) y ix) del numeral 4.2.7.1, generalmente se observan como
crecimiento diferenciable de otras colonias y se cuentan como tales. Los
crecimientos tipo x) del numeral 4.2.7.1, reportarlos como crecimiento
extendido. En caso de que una dilución se encuentre dentro del rango y otra
dilución presente colonias de crecimiento extendido, reportar la dilución en la
que se pueden contar las colonias, véase el cuadro 2, ejemplo 5.
xii) Placas sin colonias.- Cuando las placas de
todas las diluciones no muestran colonias, reportar la cuenta en placa como
menor que una vez el valor de la dilución más baja usada, véase el cuadro 2, ejemplo 6.
xiii) Placas corridas por duplicado, una con
crecimiento dentro del intervalo adecuado y otra con más de 250 colonias.-
Cuando una placa tiene entre 25 y 250 colonias y su duplicado más de 250
colonias, contar ambas placas incluyendo la que está fuera del intervalo para
determinar la cuenta en placa, véase el cuadro 2, ejemplo 7.
xiv) Placas corridas por duplicado, una placa de
cada dilución dentro del intervalo de 25 a 250 colonias.- Cuando una placa
dentro de diferentes diluciones contiene el número de colonias especificadas en
el intervalo, contar el número de colonias de las cuatro placas para calcular
la cuenta en placa, véase el cuadro 2, ejemplo 8.
xv) Placas corridas por duplicado, ambas placas
de una dilución dentro del intervalo de 25 a 250 y sólo una de la otra dilución
dentro del mismo. Contar las cuatro cajas incluyendo aquélla con menos de 25 o
más de 250 colonias, para calcular la cuenta en placa, véase el cuadro 2,
ejemplo 9.
xvi) Después de contabilizar las colonias en las
placas seleccionadas, multiplicar por la inversa de la dilución para obtener el
número de UFC por mililitro o gramo de la muestra. Redondear la cifra obtenida en la cuenta de manera que sólo aparezcan dos
dígitos significativos al inicio de esta cifra. Para redondear, elevar el
segundo dígito al número inmediato superior cuando el tercer dígito de la
derecha sea cinco o mayor (por ejemplo: 128 redondear a 130). Si el tercer
dígito es cuatro o menos, reemplazar el tercer dígito con cero y el segundo
dígito mantenerlo igual (Por ejemplo:
4.2.8
Informe de la prueba
Reportar como: Unidades formadoras de
colonias, ___ UFC/g o ml, de bacterias aerobias en placa en agar triptona
extracto de levadura o agar para cuenta estándar, incubadas ________ horas a
_______ ºC.
CUADRO
2
Cálculo de los valores de la cuenta en placa
(ensayos por duplicado)
|
Ejemplo |
|
Colonias
contadas |
|
UFC/
g o ml |
|
número |
1:100 |
1:1,000 |
1:10,000 |
|
|
1 |
>250 |
178 |
16 |
180,000 |
|
|
>250 |
190 |
17 |
|
|
2 |
>250 |
220 |
25 |
250,000 |
|
3 |
18 |
2 |
0 |
1,600 |
|
|
14 |
0 |
0 |
|
|
4 |
>250 |
>250 |
512 |
5,000,000 |
|
|
>250 |
>250 |
495 |
|
|
5 |
>250 |
235 |
Crecimiento extendido |
|
|
6 |
0 |
0 |
0 |
<100 |
|
7 |
>250 |
240 |
24 |
250,000 |
|
|
>250 |
268 |
19 |
|
|
8 |
>250 |
216 |
23 |
280,000 |
|
|
>250 |
262 |
42 |
|
|
9 |
>250 |
215 |
20 |
23,000 |
|
|
>250 |
235 |
26 |
|
|
|
>250 |
275 |
32 |
270,000 |
|
|
>250 |
225 |
26 |
|
4.3 Método para la cuenta de microorganismos
coliformes totales en placa.
4.3.1
Introducción
El grupo de los microorganismos coliformes es
el más ampliamente utilizado en la microbiología de los alimentos como
indicador de prácticas higiénicas inadecuadas.
El uso de los coliformes como indicador
sanitario puede aplicarse para:
La detección de prácticas sanitarias
deficientes en el manejo y en la fabricación de los alimentos.
La evaluación de la calidad microbiológica de
un producto, aunque su presencia no necesariamente implica un riesgo sanitario.
Evaluación de la eficiencia de prácticas
sanitarias e higiénicas del equipo.
La calidad sanitaria del agua y hielo
utilizados en las diferentes áreas del procesamiento de alimentos.
La demostración y la cuenta de microorganismos
coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivos líquidos
o sólidos con características selectivas o diferenciales.
4.3.2
Fundamento
El método permite determinar el número de
microorganismos coliformes presentes en una muestra, utilizando un medio
selectivo (agar rojo violeta bilis) en el que se desarrollan bacterias a 35°C
en aproximadamente 24 h, dando como resultado la producción de gas y ácidos
orgánicos, los cuales viran el indicador de pH y precipitan las sales biliares.
4.3.3
Reactivos y materiales
4.3.3.1
Reactivos
Los reactivos que a continuación se mencionan,
deben ser grado analítico y cuando se indique agua debe entenderse como agua
destilada.
i) Soluciones diluyentes
Solución reguladora de fosfatos (solución
concentrada)
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Fosfato monopotásico |
34,0 g |
|
Agua |
1,0 l |
Preparación:
Disolver el fosfato en 500 ml de agua y
ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1,0 N.
Llevar con agua a un litro.
Esterilizar a 121± 1,0°C durante 15 minutos.
Conservar en refrigeración (solución concentrada).
Tomar 1,25 ml de la solución concentrada y
llevar a un litro con agua (solución de trabajo).
Distribuir en porciones de 99,90 y 9 ml según
se requiera.
Esterilizar durante 15 minutos a 121± 1,0°C.
Después de la esterilización, el pH y los
volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a los iniciales.
ii) Agua peptonada
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Peptona |
1,0 |
|
NaCl |
8,5
g |
|
Agua |
1,0
l |
Preparación:
Disolver los componentes en un litro de agua.
Ajustar el pH a 7,0 con hidróxido de sodio 1,0
N.
Distribuir en porciones de 99,90 y 9 ml o en
cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera.
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0°C.
Después de la esterilización, los volúmenes finales
de la solución de trabajo deben ser iguales a los iniciales.
Si este diluyente no es usado inmediatamente,
almacenar en lugar obscuro a una temperatura entre 0 a 5°C por un tiempo no
mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición.
iii) Medio de cultivo
Agar-rojo- violeta-bilis -lactosa (RVBA)
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Peptona |
7,0 g |
|
Extracto de levadura |
3,0 g |
|
Lactosa |
10,0 g |
|
Sales biliares |
1,5 g |
|
Cloruro de sodio |
5,0 g |
|
Rojo neutro |
0,03 g |
|
Cristal violeta |
0,002 g |
|
Agar |
15,0 g |
|
agua |
1,0 l |
Preparación:
Mezclar los componentes en el agua y dejar
reposar durante algunos minutos.
Mezclar perfectamente y ajustar el pH a 7,4
con ácido clorhídrico 0,1N o con hidróxido de sodio 0,1N a 25°C, de forma que
después del calentamiento se mantenga en este valor.
Calentar con agitación constante y hervir
durante 2 minutos.
Enfriar inmediatamente el medio en un baño de
agua hasta que llegue a 45°C.
Evitar el sobrecalentamiento del medio.
No debe esterilizarse en autoclave.
Usar el medio dentro de las tres primeras
horas después de su preparación.
En el caso de utilizar medio de cultivo
deshidratado, seguir las instrucciones del fabricante.
4.3.3.2
Materiales
Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1
ml (o si es necesario de 11 y 2 ml), con tapón de algodón.
Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes
iguales a una décima de su volumen total.
Frascos de vidrio de 250 ml con tapón de
rosca.
Tubos de 16 X 150 mm con tapón de rosca.
Utensilios esterilizables para la obtención de
muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas, etc.
Cajas Petri.
Todo el material e instrumentos que tengan
contacto con las muestras bajo estudio debe esterilizarse mediante:
Horno, durante 2 h a 170 -
El material de vidrio puede sustituirse por
material desechable que cumpla con las especificaciones deseadas. No debe
usarse material de vidrio dañado por las esterilizaciones repetidas y éste debe
ser químicamente inerte.
4.3.4
Aparatos e instrumentos
Horno para esterilizar que alcance una
temperatura mínima de 170°C.
Autoclave con termómetro y manómetro,
calibrada con termómetro de máximas y mínimas.
Baño de agua con control de temperatura y
circulación mecánica, provista con termómetro calibrado con divisiones de 0,1°
C y que mantenga la temperatura a 45 ± 1,0°C.
Licuadora de una o dos velocidades controladas
por un reóstato o bien un homogeneizador peristáltico (Stomacher).
Vasos para licuadora con tapa esterilizables o
bolsas estériles para homogeneizador peristáltico.
Incubadora con termostato que evite
variaciones mayores de ± 1,0° C, provista con termómetro calibrado.
Contador de colonias de campo oscuro, con luz
adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente amplificador.
Registrador mecánico o electrónico.
Microscopio óptico.
Potenciómetro con una escala mínima de 0,1
unidades de pH a 25 °C.
4.3.5
Preparación de la muestra
La preparación de la muestra debe ser de
acuerdo a lo establecido en 4.1 Preparación y dilución de muestras de alimentos
para su análisis microbiológico.
4.3.6
Procedimiento
4.3.6.1
Colocar en cajas Petri por
duplicado 1 ml de la muestra líquida directa o de la dilución primaria,
utilizando para tal propósito una pipeta estéril.
4.3.6.2
Repetir el procedimiento
tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar, utilizando una
pipeta estéril diferente para cada dilución.
4.3.6.3
Vertir de
4.3.6.4
Mezclar cuidadosamente el inóculo
con el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis movimientos en
el sentido de las manecillas del reloj, seis movimientos en el sentido
contrario al de las manecillas del reloj y seis de atrás para adelante, sobre
una superficie lisa y nivelada. Permitir que la mezcla solidifique dejando las
cajas Petri reposar sobre una superficie horizontal fría.
4.3.6.5
Preparar una caja control con
15 ml de medio para verificar la esterilidad.
4.3.6.6
Después de que está el medio
completamente solidificado en la caja, verter aproximadamente 4 ml del medio
RVBA a 45 ± 1,0°C en la superficie del medio inoculado. Dejar que solidifique.
4.3.6.7
Invertir las placas y
colocarlas en la incubadora a 35°C, durante 24 ± 2 horas.
4.3.6.8
Después del periodo especificado
para la incubación, contar las colonias con el contador de colonias.
4.3.6.9
Seleccionar las placas que
contengan entre 15 y 150 colonias. Las colonias típicas son de color rojo
oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un halo de precipitación debido
a las sales biliares, el cual es de color rojo claro o rosa, la morfología
colonial es semejante a lentes biconvexos con un diámetro de 0,5 a 2,0 mm.
4.3.7
Expresión de los resultados
4.3.7.1
Cálculo del método
i) Placas que contienen entre 15 y 150 colonias
características.
Separar las placas que contienen el número
antes mencionado de colonias características en dos diluciones consecutivas.
Contar las colonias presentes. Calcular el número de coliformes por mililitro o
por gramo de producto, multiplicando el número de colonias por el inverso de la
dilución correspondiente, tomando los criterios del punto 4.2. Método para
ii) Placas que contienen menos de 15 colonias
características.
Si cada una de las placas tiene menos de 15
colonias características, reportar el número obtenido seguido de la dilución
correspondiente.
iii)
Placas con colonias no
características.
Si en las placas no hay colonias
características, reportar el resultado como: menos de un coliforme por 1/d por
gramo, en donde d es el factor de dilución.
4.3.8
Informe de la prueba
Informar: UFC/g o ml en placa de agar rojo
violeta bilis, incubados a 35°C durante 24 ± 2 h.
En caso de emplear diluciones y no observar
crecimiento, informar utilizando como referencia la dilución más baja
utilizada, por ejemplo dilución 10-1.
En caso de no observar crecimiento en la
muestra sin diluir se informa: "no desarrollo de coliformes por ml".
4.4 Método para la determinación de Salmonella en alimentos.
4.4.1
Introducción
Los miembros del género Salmonella han sido muy estudiados como patógenos cuando se
encuentran presentes en los alimentos. El control de este microorganismo, tanto
por parte de las autoridades sanitarias, como en las plantas procesadoras de
alimentos, depende en cierta medida del método analítico utilizado para su
detección.
Este microorganismo fue inicialmente
identificado en muestras clínicas y los métodos empleados para estos casos se
adaptaron posteriormente para su detección en alimentos. Las modificaciones a
los métodos consideraron dos aspectos principales, el primero es el
debilitamiento o daño a las células bacterianas presentes en un alimento,
debido al proceso a que está sujeto (por ejemplo: tratamiento térmico, secado,
etc.) y segundo, la variabilidad inherente a la naturaleza del producto bajo
estudio. Para diversos alimentos existen diferentes protocolos para el
aislamiento de Salmonella, todos
ellos son esencialmente similares en principio y emplean las etapas de
preenriquecimiento, enriquecimiento selectivo, aislamiento en medios de cultivo
selectivos y diferenciales, identificación bioquímica y confirmación serológica
de los microorganismos.
4.4.2
Fundamento
La presente técnica para la detección de Salmonella en alimentos, describe un
esquema general que consiste de 5 pasos básicos:
4.4.2.1
Preenriquecimiento, es el
paso donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no selectivo, que
permite restaurar las células de Salmonella
dañadas a una condición fisiológica estable.
4.4.2.2
Enriquecimiento selectivo,
empleado con el propósito de incrementar las poblaciones de Salmonella e inhibir otros organismos
presentes en la muestra.
4.4.2.3
Selección en medios sólidos,
en este paso se utilizan medios selectivos que restringen el crecimiento de
otros géneros diferentes a Salmonella y
permite el reconocimiento visual de colonias sospechosas.
4.4.2.4
Identificación bioquímica,
este paso permite la identificación génerica de los cultivos de Salmonella y la eliminación de cultivos
sospechosos falsos.
4.4.2.5
Serotipificación, es una
técnica serológica que permite la identificación específica de un cultivo.
4.4.3
Reactivos y materiales
En caso de disponerse de fórmulas comerciales
deshidratadas, se deben seguir las instrucciones impresas en la etiqueta
respectiva para su preparación.
Las sustancias químicas usadas para preparar
los medios de cultivo y los reactivos deben ser grado analítico.
4.4.3.1
Reactivos
i) Medios de pre-enriquecimiento
Agua de peptona tamponada
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Peptona |
10,0 g |
|
Cloruro de sodio |
5,0 g |
|
Fosfato sódico dibásico |
3,5 g |
|
Fosfato potásico monobásico |
1,5 g |
|
Agua |
1,0 l |
Preparación
Disolver los componentes en agua, calentando
si es necesario.
Ajustar el pH, si es necesario, después de la
esterilización a 7,0.
Distribuir en recipientes de vidrio
esterilizables con la capacidad necesaria para obtener las porciones necesarias
para la prueba.
Esterilizar por 20 min a 121 ± 1ºC.
Caldo lactosado
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Extracto de carne |
3,0 g |
|
Peptona |
5,0 g |
|
Lactosa |
5,0 g |
|
Agua destilada |
1,0 g |
|
pH final 6,9 + 0,2 |
|
Preparación
Disolver los ingredientes en agua, calentando
a 65ºC.
Distribuir en porciones de 225 ml, en frascos
de 500 ml.
Esterilizar durante 15 min a 121ºC ± 1ºC.
ii) Caldo de enriquecimiento
Caldo selenito-cistina
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Tristona o polipeptona |
5,0 g |
|
Lactosa |
4,0 g |
|
Fosfato disódico |
10,0 g |
|
Selenito ácido de sodio |
4,0 g |
|
L- cistina |
0,01 g |
|
Agua destilada |
1,0 l |
|
pH final 7,0 + 2 a 25°C |
|
Preparación
Disolver los ingredientes en un litro de agua
destilada estéril y distribuir en volúmenes de 10 y 225 ml en recipientes
estériles, según se requiera.
El caldo así preparado es transparente. De
preferencia usarlo el mismo día de su preparación.
Si se desea conservar el medio por varios
días, puede exponerse al calor en autoclave por 5 min a
Caldo tetrationato
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Proteosa peptona o triptona |
5,0 g |
|
Sales biliares |
1,0 g |
|
Carbonato de calcio |
10,0 g |
|
Tiosulfato de sodio
pentahidratado |
30,0 |
|
Agua destilada |
1,0 l |
|
pH final 7,0 + 0,1 |
|
Preparación
Disolver los ingredientes en un litro de agua
destilada estéril.
Distribuir, agitando constantemente, en
porciones de 10 y 225 ml, en recipientes estériles. Guardar en refrigeración.
Antes de usar el medio, agregar 2 ml de una
solución yodo-yoduro y 1 ml de solución de verde brillante al 0,1% por cada 100
ml de caldo. El medio una vez adicionado de yodo no debe calentarse y debe
usarse el mismo día de su preparación.
Vassiliadis-Rappaport
|
Fórmula |
|
|
Solución A |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Tristona |
5,0 g |
|
Cloruro de sodio |
8,0 g |
|
Fosfato de potasio
hidrogenado |
1,6 g |
|
Agua destilada |
1,0 l |
Disolver los componentes en agua por
calentamiento cercano a 70ºC.
|
Solución B |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Cloruro de magnesio
hexahidratado |
400 g |
|
Agua destilada |
1,0 l |
Disolver el cloruro de magnesio en agua.
Como esta sal es muy higroscópica es
conveniente disolver el contenido entero de cloruro de magnesio desde un recipiente
recientemente abierto de tal modo que la concentración de la solución sea de
0,4 g/ml.
Conservar en frasco ámbar a temperatura
ambiente.
|
Solución C |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Oxalato de verde de malaquita |
0,4 g |
|
Agua destilada |
100 ml |
Disolver el oxalato de verde de malaquita en
agua.
Conservar en frasco ámbar a temperatura
ambiente.
|
Medio completo |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Solución A |
1,000 ml |
|
Solución B |
100 ml |
|
Solución C |
10 ml |
Preparación
Adicionar 1 000 ml de la solución A, 100 ml de
la solución B y 10 ml de la solución C.
Ajustar el pH si es necesario, de tal manera
que después de la esterilización sea de 5,2.
Distribuir antes de usar dentro de tubos en
cantidades de 10 ml.
Almacenar en refrigeración.
Caldo de soya tripticasa
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Tripticasa o triptosa |
17,0 g |
|
Fitona |
3,0 g |
|
Glucosa |
2,5 g |
|
Cloruro de sodio |
2,5 g |
|
Agua destilada |
1,0 g |
|
pH final 7,3 + 0,2 |
|
Preparación
Disolver los ingredientes en 1 litro de agua
destilada, calentando lentamente hasta su disolución completa.
Distribuir porciones de 225 ml dentro de
matraces de 500 ml y esterilizar en autoclave durante 15 min a 121ºC ± 1ºC.
Leche descremada reconstituida
Suspender 100 g de leche descremada en polvo
en un litro de agua destilada. Agitar circularmente hasta disolución.
Distribuir en volúmenes de 225 ml en matraces Erlenmeyer de 500 ml. Esterilizar
a 121ºC ± 1ºC por 15 min. El volumen final debe corregirse para mantener 225
ml.
Caldo soya tripticasa estéril adicionado con
sulfito de potasio
Adicionar al caldo soya tripticasa 5 g de
sulfito de potasio por cada 1000 ml de medio, quedando una concentración final
de sulfito de potasio del 0,5%. Adicionar el sulfito de potasio antes de
esterilizar en autoclave en la forma habitual.
iii) Medios de aislamiento
Agar verde brillante (VB)
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Extracto de levadura |
3,0 g |
|
Polipeptona (proteosa peptona
No. 3) |
10,0 g |
|
Cloruro de sodio |
5,0 g |
|
Lactosa |
10,0 g |
|
Sacarosa |
10,0 g |
|
Rojo de fenol |
0,08 g |
|
Agar |
20,0 g |
|
Verde brillante |
0,0125 g |
|
Agua destilada |
1,0 l |
|
pH final 6,9 ± 0,2 |
|
Preparación
Suspender los ingredientes en un litro de agua
destilada y calentar a ebullición, hasta disolución completa. Ajustar el pH.
Esterilizar en autoclave por 15 min a
Enfriar el medio a 50ºC y distribuirlo en
cajas de petri estériles. El aspecto del medio es obscuro, de color marrón.
Agar con sulfito de bismuto
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Extracto de carne de res |
5,0 g |
|
Mezcla de peptonas |
10,0 g |
|
Glucosa |
5,0 g |
|
Fosfato disódico (anhidro) |
5,0 g |
|
Sulfato ferroso (anhidro) |
0,3 g |
|
Sulfito de bismuto |
8,0 g |
|
Verde brillante |
0,025 g |
|
Agar |
20,0 g |
|
Agua destilada |
1,0 l |
|
pH final |
7,6 + 0,2 |
Preparación
Suspender los ingredientes en un litro de
agua. Calentar hasta su disolución completa, agitando frecuentemente. Ajustar
el pH.
Enfriar a 45ºC y verter en cajas de petri
estériles, distribuyendo de manera homogénea el precipitado propio del medio.
El aspecto de las placas es opaco, de color
verde pálido y deben usarse el mismo día de su preparación. Si la coloración es
parda, no deben utilizarse.
El medio no debe esterilizarse en autoclave;
el sobrecalentamiento afecta su selectividad.
Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Xilosa |
3,75 g |
|
L- lisina |
5,0 g |
|
lactosa |
7,5 g |
|
Sacarosa |
7,5 g |
|
Cloruro de sodio |
5,0 g |
|
Extracto de levadura |
3,0 g |
|
Rojo de fenol |
0,08 g |
|
Agar |
15,0 g |
|
Desoxocolato de sodio |
2,5 g |
|
Citrato férrico- amónico |
0,8 g |
|
Tiosulfato de sodio |
6,8 g |
|
Agua destilada |
1,0 l |
|
pH final |
6,9 + 0,2 |
Preparación
Suspender los ingredientes en un litro de agua
destilada, y calentar en baño de agua a 55ºC, agitando frecuentemente, hasta
disolución completa. Ajustar el pH.
Enfriar a 50ºC y verter en cajas de petri estériles.
No se esterilice.
El sobrecalentamiento produce una
precipitación; la reactividad del medio puede ser satisfactoria, pero las
colonias suelen ser muy pequeñas.
El aspecto del medio es claro y de color rojo
brillante.
Agar para Salmonella y Shigella (SS)
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Extracto de carne |
5,0 g |
|
Polipeptona |
5,0 g |
|
Lactosa |
10,0 g |
|
Sales biliares |
8,5 g |
|
Citrato de sodio dihidratado |
8,5 g |
|
Tiosulfato de sodio
pentahidratado |
8,5 g |
|
Citrato férrico |
1,0 g |
|
Agar |
13,5 g |
|
Rojo neutro |
0,025 g |
|
Verde brillante |
0,33 mg |
|
Agua destilada |
1,0 l |
|
pH final 7,0 + 0,2 |
|
Preparación
Suspender los ingredientes en
un litro de agua destilada estéril y calentar a ebullición hasta disolución
completa. Ajustar el pH. No esterilizar en autoclave.
Enfriar a 50ºC y distribuir en
cajas de petri estériles en condiciones asépticas.
El aspecto del medio fundido es
claro y de color rosado.
Agar entérico Hektoen
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Proteosa
peptona |
12,0 g |
|
Extracto
de levadura |
3,0 g |
|
Lactosa |
12,0 g |
|
Sacarosa
|
12,0 g |
|
Salicilina
|
2,0 g |
|
Sales
biliares |
9,0 g |
|
Cloruro
de sodio |
5,0 g |
|
Tiosulfato
de sodio |
5,0 g |
|
Citrato
amónico férrico |
1,5 g |
|
Azul de
bromotimol |
0,064 g |
|
Fascina
ácida |
0,1 g |
|
Agar |
13,5 g |
|
Agua |
1,0 l |
|
pH final |
7,5 +
0,2 |
Preparación
Suspender los ingredientes en
agua destilada, hervir con agitación hasta completa disolución del agar.
No sobrecalentar.
Dejar enfriar a 55-60ºC y
distribuir en cajas de petri estériles en condiciones asépticas.
iv) Medios para
pruebas bioquímicas
Agar de tres azúcares y hierro (TSI)
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Peptona
de carne |
1,0 g |
|
Paptona
de caseína |
1,0 g |
|
Cloruro
de sodio |
0,5 g |
|
Lactosa |
1,0 g |
|
Sacarosa
|
1,0 g |
|
Glucosa |
0,1 g |
|
Agar |
1,3 g |
|
Rojo de
fenol |
2,5 mg |
|
Sulfato
ferroso amónico pentahidratado |
20,0 mg |
|
Tiosulfato
de sodio |
20,0 mg |
|
Agua
destilada |
100 ml |
|
pH final
7,3 + 0,2 |
|
Preparación
Suspender los ingredientes en 100 ml de agua
destilada. Calentar a ebullición, agitando ocasionalmente, hasta disolución
completa.
Enfriar a 60ºC y ajustar el pH.
Distribuir en volúmenes de 3 ml en tubos de 13
x 100 mm y esterilizar a 121ºC ± 1ºC durante 15 min.
Inclinar los tubos de manera que el medio de
cultivo en el fondo alcance una altura de 3 cm y una profundidad de 4 cm. El
medio es de color rojo.
Agar de hierro y lisina (LIA)
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Peptona de gelatina |
0,5 g |
|
Extracto de levadura |
0,3 g |
|
Glucosa |
0,1 g |
|
L-lisina |
1,0 g |
|
Citrato férrico amónico |
50 mg |
|
Tiosulfato de sodio anhidro |
4,0 mg |
|
Púrpura de bromocresol |
2,0 mg |
|
Agar |
1,5 g |
|
Agua destilada |
100 ml |
|
pH final |
6,7 + 0,2 |
Preparación
Suspender los ingredientes en el agua
destilada y mezclar bien, calentar hasta ebullición con agitación frecuente
hasta conseguir la disolución completa. Ajustar el pH.
Distribuir en volúmenes de 3 ml en tubos de 13
x 100 mm, con tapón de rosca.
Esterilizar en autoclave a 121ºC ± 1ºC durante
12 min. Dejar que los tubos se enfríen en posición inclinada, de tal modo que
se obtengan columnas de medio de 4 cm y una superficie inclinada de 2 cm.
El medio ya preparado es de color púrpura.
Agar nutritivo
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Extracto de carne |
3,0 g |
|
Peptona |
5,0 g |
|
Agar |
15,0 g |
|
Agua destilada |
1,0 l |
|
pH final |
6,8 + 0,2 |
Preparación
Suspender los ingredientes en agua. Dejar
reposar de 5 a 10 min.
Calentar a ebullición hasta disolución
completa. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm, en cantidades de 1/3 de su
volumen.
Esterilizar a 121ºC ± 1ºC por 15 min. Inclinar
los tubos antes que el agar solidifique.
Medio de SIM (para Sulfuro, Indol y Movilidad)
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Extracto de carne |
3,0 g |
|
Peptona |
30,0 g |
|
Hierro peptonizado |
0,20 g |
|
Tiosulfato de sodio |
0,025 g |
|
Agua destilada |
1,0 l |
|
pH final |
7,3 + 0,2 |
Preparación
Suspender los ingredientes en el agua
destilada, calentar a ebullición agitando frecuentemente hasta lograr una
disolución completa.
Enfriar a 50ºC y ajustar el pH.
Distribuir el medio en volúmenes de 3 ml en
tubos de 13 x
Agar citrato de Simmons
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Fosfato de amonio |
1,0 g |
|
Fosfato dipotásico |
1,0 g |
|
Cloruro de sodio |
5,0 g |
|
Citrato de sodio |
2,0 g |
|
Sulfato de magnesio |
0,20 g |
|
Azul de bromotimol |
0,08 g |
|
Agar |
15,0 g |
|
Agua destilada |
1,0 l |
|
pH final |
6,8 + 0,2 |
Preparación
Suspender los ingredientes en el agua
destilada, calentar a ebullición agitando frecuentemente hasta lograr una
disolución completa.
Ajustar el pH.
Distribuir el medio en volúmenes de 3 ml en
tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121ºC ± 1ºC durante 15 min.
Dejar enfriar los tubos en posición inclinada.
Caldo MR-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer)
|
Fórmula |
|
|
ingredientes |
Cantidades |
|
Peptona |
7,0 g |
|
Dextrosa |
5,0 g |
|
Difosfato de potasio |
5,0 g |
|
Agua destilada |
1,0 l |
|
pH final |
6,9 + 0,2 |
Preparación
Suspender los ingredientes en el agua
destilada, calentar a ebullición agitando frecuentemente hasta lograr una
disolución completa.
Ajustar el pH.
Distribuir el medio en volúmenes de 3 ml en
tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121ºC ± 1ºC durante 15 min.
Caldo manitol
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Extracto de carne |
1,0 g |
|
Proteosa peptona |
10,0 g |
|
Cloruro de sodio |
5,0 g |
|
Rojo de fenol |
0,018 g |
|
Manitol |
10,0 g |
|
Agua |
1,0 l |
|
pH final |
7,4 + 0,2 |
Preparación
Suspender 26 g del medio deshidratado en un
litro de agua, mezclar y ajustar el pH.
Distribuir en volúmenes de 2 a 3 ml en tubos
de 13 x 100 mm.
Esterilizar a 121ºC ± 1ºC durante 15 min.
Caldo malonato
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Extracto de levadura |
1,0 g |
|
Sulfato de amonio |
2,0 g |
|
Fosfato dipotásico |
0,6 g |
|
Fosfato monopotásico |
0,6 g |
|
Cloruro de sodio |
2,0 g |
|
Malonato |
3,0 g |
|
Glucosa |
0,250 g |
|
Azul de bromotimol |
0,025 g |
|
Agua |
1,0 l |
|
pH final |
6,7 + 0,2 |
Preparación
Suspender los ingredientes en agua, mezclar y
ajustar el pH.
Distribuir en tubos de 13 x 100 mm en
cantidades de 3 ml.
Esterilizar en autoclave a 121ºC ± 1ºC durante
15 min.
Caldo urea
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Urea |
20,0 g |
|
Extracto de levadura |
0,1 g |
|
Fosfato monopotásico |
9,10 g |
|
Fosfato dipotásico |
9,5 g |
|
Rojo de fenol |
0,01 g |
|
Agua |
1,0 l |
|
pH final |
6,8 + 0,2 |
Preparación
Disolver los ingredientes en agua destilada.
NO CALENTAR. Esterilizar por filtración a
través de membrana 0,45 µm o en autoclave de 5 a 8 lb de presión durante 15
min.
Distribuir asépticamente de 1,5 a 3 ml en
tubos estériles de 13 x 100 mm.
Caldo de urea rápido
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Urea |
20,0 g |
|
Extracto de levadura |
0,10 g |
|
Fosfato monopotásico |
0,091 g |
|
Fosfato dipotásico |
0,095 g |
|
Rojo de fenol |
0,010 g |
|
Agua |
1,0 l |
|
pH final |
6,8 + 0,2 |
Preparación
Disolver los ingredientes en agua destilada.
NO CALENTAR. Esterilizar por filtración a
través de membrana 0,45 µm.
Distribuir asépticamente de 1,5 a 3 ml en
tubos estériles de 13 x 100 mm.
Caldo infusión cerebro corazón
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Infusión cerebro corazón |
200,0 g |
|
Infusión de corazón de res |
250,0 g |
|
Proteosa peptona |
10,0 g |
|
Cloruro de sodio |
5,0 g |
|
Fosfato disódico
dodecahidratado |
2,5 g |
|
Dextrosa |
2,0 g |
|
Agua destilada |
1,0 l |
|
pH final |
7,4 ± 0,2 |
Preparación
Disolver los ingredientes en agua destilada,
calentar suavemente.
Distribuir y esterilizar a 121ºC ± 1ºC durante
15 min.
v) Soluciones
Solución verde brillante al 0,1% (1:1000)
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Verde brillante |
0,1 g |
|
Agua destilada estéril |
100,0 ml |
Disolver 0,1 g de verde brillante en agua
destilada estéril hasta completar 100 ml.
Solución de yodo-yoduro
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Cristales de yodo |
6,0 g |
|
Yoduro de potasio |
6,0 g |
|
Agua destilada |
100,0 ml |
Disolver los cristales y el yoduro de potasio
en agua destilada hasta completar 100 ml.
Conservar en frasco ámbar.
Solución salina al 0,85%
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Cloruro de sodio |
0,85 g |
|
Agua destilada |
100,0 ml |
Disolver el cloruro de sodio en el agua y
esterilizar a 121°C ± 1°C durante 15 min.
Solución salina formalizada
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Solución de formaldehído
(36-38 %) |
6,0 ml |
|
Cloruro de sodio |
8,5 g |
|
Agua destilada |
1,0 l |
Disolver 8,5 g de cloruro de sodio en 1 litro
de agua destilada. Esterilizar a 121ºC ± 1ºC durante 15 min.
Enfriar a temperatura ambiente. Adicionar 6 ml
de la solución de formaldehído. No esterilizar después de la adición de
formaldehído.
Reactivo de Kovac
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
p-dimetil-aminobenzaldehído |
5,0 g |
|
Alcohol amílico |
75,0 ml |
|
Acido clorhídrico concentrado |
25,0 ml |
Disolver el p-dimetil-aminobenzaldehído en el
alcohol amílico y después agregar el ácido clorhídrico lentamente. Conservar en
frasco ámbar en refrigeración.
Solución de alfa-naftol al 5%
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Alfa-naftol |
5,0 g |
|
Alcohol |
100,0 ml |
Disolver 5 g de alfa-naftol en alcohol hasta
completar 100 ml.
Solución de rojo de metilo
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Rojo de metilo |
0,10 g |
|
Alcohol etílico |
300,0 ml |
|
Agua destilada c.b.p. |
500,0 ml |
Disolver el rojo de metilo en el alcohol
etílico y adicionar agua hasta completar 500 ml.
Solución de hidróxido de potasio al 40%
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Hidróxido de potasio |
40,0 g |
|
Agua destilada |
100,0 ml |
Disolver 40 g de hidróxido de potasio en agua
hasta completar 100 ml.
Solución de gelatinasa al 5%
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Gelatinasa |
5,0 g |
|
Agua |
100,0 ml |
Disolver 5 g de gelatinasa en 100 ml de agua
destilada. NO CALENTAR.
vi) Antisueros
Antisuero polivalente somático (O)
Antisuero polivalente flagelar (H)
Antisuero Vi
4.4.3.2
Material
Matraces Erlenmeyer de 500 ml
Recipientes de boca ancha, de capacidad
apropiada para contener las muestras simples y compuestas
Angulos de vidrio
Cucharas, bisturíes, cuchillos y pinzas
Tubos de ensaye de 16 x 150 mm y de 20 x 100
mm
Tubos para serología de 10 x 75 mm o de 13 x
100 mm
Pipetas bacteriológicas de 10,0 y 5,0 ml,
graduadas en 0,1 ml y protegidas con tapón de algodón
Pipetas de 1 ml, con graduaciones de 0,01 ml
Cajas de petri estériles de vidrio o
desechables
Rejillas para tubos de ensaye
Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3
mm de diámetro
Papel pH (intervalo de 6-8) con graduaciones
máximas de 0,4 unidades de pH para cambios de color
Todo el material que tenga contacto con las
muestras bajo estudio debe esterilizarse mediante:
Horno, durante 2 horas a 170-175ºC o
autoclave, durante 15 min como mínimo a 121ºC ± 1ºC
4.4.4
Equipo
Horno para esterilizar que alcance los 180ºC
Incubadora con termostato para evitar
variaciones mayores de ± 0,1ºC y termómetro
Autoclave con termómetro o manómetro, probado
con termómetro de máximas
Baño maría con termostato y termómetro
Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g
Licuadora de una o dos velocidades controladas
por un reóstato, con vasos esterilizables (vidrio o aluminio)
Mecheros Bunsen o Fisher
Potenciómetro
4.4.5
Procedimiento
4.4.5.1
Preparación de los alimentos
para el aislamiento de Salmonella
Los siguientes métodos se basan en el análisis
de 25 g de la muestra analítica en una proporción de 1:9 de muestra/caldo. Esta
cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporción. Se
recomienda una muestra de 25 g o más.
i) Procedimiento general para la preparación de
muestras
Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un
vaso estéril de licuadora o en bolsa estéril para trabajar en homogeneizador
peristáltico (stomacher). Adicionar 225 ml del medio de preenriquecimiento
estéril (generalmente caldo lactosado, a menos que se indique otro) y licuar si
es necesario durante un min.
Transferir asépticamente la mezcla
homogeneizada a un recipiente estéril de boca ancha con tapón de rosca y dejar
reposar por 60 min. a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada. Mezclar
bien y determinar el pH aproximado con papel pH. Ajustar, si es necesario, a un
pH 6,8 ± 0,2 con hidróxido de sodio 1N o ácido clorhídrico 1N estériles.
Mezclar y cubrir el recipiente enroscando suavemente la tapa.
Incubar 24 ± 2 h a 35ºC. Continuar como se
indica en el punto i) del numeral 4.4.5.2
ii) Procedimiento específico para la preparación
de muestra según el producto
iii) Huevo en polvo, claras de huevo en polvo,
yema de huevo en polvo, huevos líquidos pasteurizados y congelados, fórmulas
infantiles y mezclas preparadas en polvo (harinas para hot cakes, galletas,
donas, bisquets y pan).
De preferencia no descongelar la muestra. Si
se requiere, preparar los alimentos congelados justo antes de tomar la muestra
analítica descongelándolos a 45ºC por 15 min. aproximadamente con agitación
constante en un baño de agua o por 18 h a una temperatura entre 2-5ºC. Los
productos que no son en polvo se trabajan como indica el procedimiento general en
el punto i) del numeral 4.4.5.1. Para los productos en polvo, pesar 25 g de
muestra analítica en el medio de preenriquecimiento, dejando que el polvo se
humecte lentamente. Si es necesario homogeneizando poco a poco con una varilla
de vidrio estéril u otra herramienta también estéril. Continuar igual que el
procedimiento general.
iv) Productos que contienen huevo en su
formulación (pastas para sopa, rollos chinos, etc.); que en el punto iii) del
numeral 4.4.5.1 utilizando caldo lactosado como medio de preenriquecimiento,
licuar dos min. Continuar después de la incubación como en el punto i) del numeral
4.4.5.2
v) Productos
procesados térmicamente y productos secos. Se sigue el procedimiento señalado
en i) de 4.4.5.1 hasta la homogeneización. Si la muestra es en polvo o molida,
el licuado puede omitirse.
Después de reposar,
mezclar bien y ajustar el pH como se indica en el procedimiento general. Para
emulsionar las grasas, agregar los detergentes en las mismas proporciones y con
las mismas recomendaciones que para el coco. La cantidad de los mismos
dependerá en gran medida de la composición del alimento. Los detergentes no
serán necesarios en los productos glandulares en polvo.
Incubar las muestras como
se indica en el punto i) del numeral 4.4.5.1
4.4.5.2 Aislamiento de
Salmonella
i) Cerrar firmemente
el tapón de rosca de los matraces con los cultivos de preenriquecimiento y
agitar suavemente, transferir respectivamente 1 ml de la mezcla a un tubo que
contenga 10 ml de caldo tetrationato y a otro con 10 ml de caldo selenito
cistina. Como alternativa, en sustitución del caldo tetrationato puede
emplearse el medio Vassiliadis-Rappaport.
ii) Incubar de 18 a 24
h a 35ºC o, para alimentos fuertemente contaminados a 42ºC por el mismo
periodo. Estriar los productos que fueron directamente enriquecidos en medios
selectivos.
iii) Mezclar el tubo
con caldo selenito cistina y estriar en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD),
agar verde brillante (VB) y una tercera caja con cualquiera de los medios
selectivos adicionales (agar entérico Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar
SS).
Efectuar el mismo
procedimiento para el caldo tetrationato. Incubar las placas 24 ± 2 h a 35ºC.
iv) Examinar las
placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella, de acuerdo con las siguientes características:
Agar XLD: colonias rosas
o rojas que pueden ser transparentes con o sin centro negro. En algunos casos
las colonias pueden aparecer completamente negras.
Agar VB: colonias rojas o
rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio enrojecido; las bacterias
fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas.
Agar entérico Hektoen:
colonias verdes o azulverdes con o sin centro negro. En algunos casos las
colonias pueden aparecer completamente negras.
Agar Sulfito de Bismuto:
las colonias típicas de Salmonella pueden
ser cafés, grises o negras; con o sin brillo metálico. Generalmente el medio
circundante (halo) es café, tornándose posteriormente negro.
Algunas cepas producen
colonias verdes sin la formación del halo oscuro. Si las placas no muestran
colonias típicas o no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales.
Agar SS: colonias
translúcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan centro negro. Las
colonias fermentadoras de la lactosa son rojas.
4.4.5.3 Identificación
bioquímica
i) Seleccionar al
menos dos colonias típicas de cada medio selectivo, que se encuentren bien aisladas.
Tocar levemente el centro
de cada colonia e inocular dos tubos, uno con agar triple azúcar hierro (TSI) y otro con agar hierro lisina (LIA), por
estría en la superficie inclinada y por punción en el fondo.
Incubar por 24 ± 2 h a
35ºC.
Almacenar en
refrigeración de 5 a 8ºC las placas con medios selectivos por si es necesario
retomar más colonias.
ii) Observar el
crecimiento en los tubos y considerar presuntivamente positivas para Salmonella las colonias que den las
siguientes reacciones:
iii) Agar TSI, en el
fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentación de la
glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo más intenso que el
medio original debido a la no fermentación de la lactosa ni de la sacarosa. En
la mayoría de los casos se observa coloración negra a lo largo de la punción
debido a la producción de ácido sulfihídrico.
iv) Agar LIA, se
observa intensificación del color púrpura en todo el tubo por la
descarboxilación de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que
produzcan claramente color amarillo en el fondo del agar. La mayoría de las
cepas de Salmonella producen ácido
sulfihídrico en este medio con ennegrecimiento a lo largo de la punción.
v) Retener todos los
cultivos que muestren las reacciones características de Salmonella en los medios TSI y LIA para las pruebas adicionales,
indicadas en el punto vi) del numeral 4.4.5.3.
vi) Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella pero que presentan reacciones
en LIA típicos, deben trabajarse como cultivos presuntivos positivos, ya que en
estos casos, el medio LIA permitirá detectar S. arizonae y cepas atípicas de Salmonella
que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamente los cultivos que
muestren reacciones atípicas en ambos medios.
vii) Continuar el análisis a partir de los tubos
de TSI con reacciones típicas. Si el cultivo presenta reacciones atípicas en
este medio, tomar colonias adicionales de las placas de donde se obtuvo el
cultivo atípico anterior y sembrar las pruebas bioquímicas nuevamente.
viii) Continuar la identificación bioquímica y
serológica a partir de los cultivos recuperados de TSI. Se recomienda trabajar
seis cultivos por cada 25 g de unidad analítica seleccionando colonias
procedentes de ambos medios de enriquecimiento.
ix) Prueba de ureasa
x) Prueba de ureasa (convencional). Con una asa
estéril, tomar crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de
medio TSI e inocular tubos de caldo urea. Utilizar un control de medio para
comparar el vire púrpura de las reacciones positivas con el color del medio
original. Incubar 24 ± 2 h a 35ºC.
xi) Prueba de ureasa (rápida). Tomar dos asadas
de crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e
inocular tubos de caldo urea (rápida). Incubar 2 h a 37 ± 0,5ºC en baño de
agua.
Descartar todos los cultivos que den ureasa
positiva. Retener los cultivos que den la prueba negativa (sin cambio de color
del medio).
4.4.5.4
Identificación serológica
i) Ensayo de los antígenos somáticos de Salmonella (Antisuero polivalente O)
ii) Colocar con una asa dos gotas separadas de
solución salina estéril sobre un portaobjetos o en dos secciones de una placa
para aglutinación. Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo
desarrollado en TSI.
iii)
Agregar a una de ellas una
gota del antisuero polivalente somático (O) y mezclar con el canto del asa o
empleando aplicadores de madera.
iv) Agitar inclinando la lámina hacia atrás y
hacia adelante durante aproximadamente un min.
Observar bajo buena iluminación sobre un fondo
oscuro.
v) Considerar cualquier grado de aglutinación
como positiva.
La prueba positiva resulta cuando se presenta
aglutinación en la gota con el cultivo y el antisuero y no aglutinación en la
gota que contiene el cultivo y la solución salina.
Si se observa aglutinación en ambas gotas, la
prueba no es definitiva y se debe continuar con las pruebas bioquímicas
complementarias.
vi) Cuando la aglutinación es positiva con el
suero polivalente O, puede determinarse el subgrupo empleando antisueros para
los diferentes subgrupos (los grupos B, C, D y E, suelen ser los más
frecuentes).
vii)
Si la aglutinación con el
antisuero O es negativa, utilizar antisuero Vi y efectuar la prueba. Si hay
aglutinación con Vi calentar el cultivo a ebullición y repetir la aglutinación
con el antisuero polivalente O.
viii)
Si no se cuenta con los
sueros grupoespecíficos, solicitar la tipificación de la cepa al Laboratorio de
Enterobacterias del Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia de
ix) Si se requiere, practicar el ensayo de los
antígenos flagelares de Salmonella (Antisuero
polivalente H).
x) Inocular el crecimiento del tubo de TSI en
agar infusión de cerebro corazón e incubar de 4 a 6 h a 35ºC hasta que se
observe crecimiento (para ensayo en el mismo día), o bien, en caldo soya
tripticaseina e incubar por 24 ± 2 h a 35ºC (para ensayo al día siguiente).
Adicionar 2,5 ml de solución salina formalizada a 5 ml del cultivo en caldo o
al cultivo en agar cerebro corazón (BHI).
xi) Colocar 0,5 ml del antisuero polivalente
flagelar (H) preparado en un tubo para serología (13 x 100 mm aproximadamente).
Adicionar 0,5 ml del cultivo formalizado. Preparar un control de solución
salina mezclando 0,5 ml de solución salina formalizada con 0,5 ml del antígeno
formalizado. Incubar las mezclas en baño de agua a 48-50ºC. Observar a
intervalos de 15 min por espacio de una h. Una prueba positiva es cuando se
observa aglutinación en la mezcla de prueba pero no en el control. Debe
interpretarse como negativa una prueba en la que ninguna de las mezclas muestre
aglutinación. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se considera la prueba
inespecífica.
4.4.5.5
Pruebas bioquímicas
complementarias
Cuando las pruebas serológicas o bioquímicas
iniciales, dan resultados atípicos o no concluyentes, realizar las pruebas que
se describen a continuación:
i) Inocular los cultivos positivos provenientes
de TSI y LIA en: medio SIM, agar citrato de Simmons, caldo manitol y caldo
RM-VP. Usar caldo malonato para confirmar la presencia de la especie S. arizonae.
ii) Interpretar los cambios en los medios
inoculados conforme lo siguiente:
iii)
Agar citrato Simmons.
Inocular por estría el tubo.
Incubar 96 ± 2 h a 35 ± 2ºC.
Prueba positiva: crecimiento acompañado de un
cambio de color de verde a azul.
Prueba negativa: ausencia de crecimiento y sin
cambio de color.
iv) Medio SIM
Inocular por punción.
Incubar 24 h a 35 ± 2ºC.
Movilidad.
Prueba positiva: crecimiento a lo largo de la
punción y en el seno del medio de cultivo.
Prueba negativa: crecimiento a lo largo de la
punción exclusivamente.
Producción de ácido sulfihídrico.
Prueba positiva: desarrollo de un color negro
a lo largo de la punción que puede extenderse a todo el medio.
Prueba negativa: ausencia de color negro.
Producción de indol.
Adicionar al tubo con medio SIM que presente
crecimiento, de 0,2 a 0,3 ml de reactivo de Kovac.
Prueba positiva: desarrollo de un anillo de
color rojo.
Prueba negativa: sin cambio de color.
v) Caldo RM-VP
Inocular un tubo con el medio.
Incubar 48 ± 2 h a 35 ± 2ºC para la prueba de
VP y 96 h para la prueba RM.
vi) Prueba de Voges-Proskauer (VP)
Transferir a un tubo un ml del cultivo de 48
h.
Adicionar 0,6 ml de solución de alfa naftol.
Adicionar 0,2 ml de solución de hidróxido de
potasio 40%.
Adicionar algunos cristales de creatinina
(opcional).
Interpretar los resultados después de incubar
2 h a 35 ± 2ºC o 4 h a temperatura ambiente.
Prueba positiva: desarrollo de color rojo
ladrillo.
Prueba negativa: sin cambio de color.
Reincubar el resto del medio RM-VP 48 h más a
35 ± 2ºC.
viii)
Prueba de rojo de metilo (RM)
Adicionar al medio de cultivo de 96 h de
incubación de dos a tres gotas de solución de rojo de metilo.
Interpretar los resultados inmediatamente.
Prueba positiva: desarrollo de color rojo.
Prueba negativa: desarrollo de color amarillo.
ix) Caldo malonato
Inocular un tubo conteniendo el
medio.
Incubar 40 ± 2 h a 35 ± 2ºC.
Prueba positiva: desarrollo de
color azul.
Prueba negativa: sin cambio de
color.
x) Caldo manitol
Inocular un tubo conteniendo el
medio.
Incubar 24 ± 2 h a 35 ± 2ºC.
Prueba positiva: desarrollo de
color amarillo.
Prueba negativa: sin cambio de
color.
xi) Consultar los
resultados obtenidos en el cuadro 2 para la identificación de los géneros de
las bacterias investigadas.
Nota: los sistemas
bioquímicos comerciales validados pueden ser usados como alternativa para las
pruebas bioquímicas convencionales.
4.4.6 Cálculo y
expresión de resultados
4.4.6.1 Interpretación
de reacciones bioquímicas y serológicas.
CUADRO
1
|
Reacciones bioquímicas |
Reacciones serológicas |
Interpretación |
|
Típica |
Antígeno
O, Vi o H positivo |
Cepas
consideradas como Salmonella |
|
Típica |
Todas
las reacciones negativas |
|
|
Típica |
No
probada |
Puede
ser Salmonella |
|
Reacciones
atípicas |
Antígeno
O, Vi o H positivo |
|
|
Reacciones
atípicas |
Todas
las reacciones negativas |
No debe
ser considerada Salmonella |
Nota: ver figura 1
CUADRO
2
|
Prueba o sustrato |
Positivo |
Negativo |
Reacción |
|
Glucosa
(TSI) |
Amarillo
|
Rojo |
+ |
|
Lisina
descarboxilasa (LIA) |
Púrpura |
Amarillo
|
+ |
|
H2S
(TSI y LIA) |
Negro |
No negro
|
+ |
|
Ureasa |
Rojo-
púrpura |
No hay
cambio de color |
- |
|
Caldo de lisina descarboxilasa |
Púrpura |
Amarillo
|
+ |
|
Caldo
dulcitol rojo de fenol |
Amarillo
o gas |
No hay
cambio de color ni gas |
+ b |
|
Caldo
KCN |
Crecimiento
|
No hay
crecimiento |
- |
|
Caldo
malonato |
Azul |
No hay
cambio de color |
- c |
|
Prueba
de indol |
Superficie
color violeta |
Superficie
color amarillo |
- |
|
Prueba
del antígeno flagelar |
Aglutinación
|
No hay
aglutinación |
+ |
|
Prueba del antígeno somático |
Aglutinación
|
No hay
aglutinación |
+ |
|
Caldo
lactosa rojo fenol |
Amarillo
o gas |
No hay
cambio de color ni gas |
- c |
|
Caldo
sacarosa rojo fenol |
Amarillo
o gas |
No hay
cambio de color ni gas |
- |
|
Prueba
Voges- proskauer |
De rosa
a rojo |
No hay
cambio de color |
- |
|
Prueba
rojo de metilo |
Rojo
difuso |
Amarillo
difuso |
+ |
|
Citrato
de Simmons |
Crecimiento
color azul |
No hay
crecimiento, no hay cambio de color |
v |
a +, 90% o más positivos en 1 o
2 días; -, 90% o más negativas en 1 o 2 días; v, variable.
b La mayoría de los cultivos S. arizonae son negativos.
c La mayoría de los cultivos S. arizonae son positivos.
4.4.6.2 Informe de
resultados
Informar: presencia o
ausencia de Salmonella en __________
g o ____________ ml de muestra.
Figura 1
DIAGRAMA DE FLUJO
PARA
4.5 Método para la determinación de Staphylococcus aureus en productos objeto
de esta norma
4.5.1
Introducción
El crecimiento de Staphylococcus aureus en alimentos tiene gran importancia por
tratarse de un microorganismo capaz de producir una poderosa enterotoxina que
al ingerirse causa intoxicaciones alimentarias.
Entre las razones para determinar el Staphylococcus aureus en alimentos
están:
Confirmar la presencia de este microorganismo
como agente causal de una enfermedad de origen alimentario.
Determinar si un alimento o ingrediente es
fuente potencial de este microorganismo enterotoxigénico.
Demostrar la contaminación postproceso la cual
es usualmente debida a contacto humano o con superficies inadecuadamente
sanitizadas.
Los alimentos sujetos a contaminación
postproceso con tipos enterotoxigénicos de Staphylococcus
aureus representan un riesgo por la ausencia de flora competitiva que
normalmente restringe el crecimiento
del Staphylococcus aureus y la
producción de enterotoxinas.
Este tipo de alimentos se vuelven más
peligrosos, si además son sujetos a un inadecuado manejo o son mantenidos a
temperaturas de conservación inapropiadas.
Los alimentos perecederos tales como: carnes
crudas y procesadas, ensaladas, productos de pastelería y productos de leche,
son los más comúnmente asociados con intoxicación estafilocóccica.
4.5.2
Fundamento
Este método permite hacer una estimación del
contenido de Staphylococcus aureus en
alimentos, se efectúa directamente en placas de medio de cultivo selectivo y
diferencial, con la confirmación mediante las pruebas de coagulasa y
termonucleasa.
Este método es adecuado para el análisis de
alimentos en los cuales se esperen más de 100 células de Staphylococcus aureus por g.
4.5.3
Reactivos y materiales
En caso de disponerse de fórmulas comerciales
deshidratadas, para su preparación se deben seguir las instrucciones impresas
en la etiqueta respectiva.
Cuando se mencione agua debe entenderse que se
trata de "agua destilada".
Los reactivos a emplear en el método objeto de
esta norma deben ser grado analítico.
4.5.3.1
Reactivos
i) Soluciones diluyentes
Solución reguladora de fosfatos (Solución concentrada)
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidad |
|
Fosfato monopotásico |
34,0 g |
|
Agua |
I,0 l |
Preparación
Disolver el fosfato en 500 ml de agua y
ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1 N, aforar con agua a 1
l.
Esterilizar durante 15 min a 121ºC ±1,
conservar en refrigeración (solución concentrada).
Tomar 1,25 ml de la solución concentrada y
llevar a 1 l con agua (solución de trabajo).
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml según
se requiera.
Esterilizar a 121ºC ±1 durante 15 min.
Después de la esterilización, los volúmenes
finales y el pH de la solución de trabajo deben ser iguales a los iniciales.
Agua peptonada
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidad |
|
Peptona |
1,0 g |
|
Cloruro de sodio |
8,5 g |
|
Agua |
1,0 l |
Preparación
Disolver los componentes en un litro de agua.
Ajustar el pH a 7,0 con solución de hidróxido
de sodio 1N.
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml según
se requiera.
Esterilizar a 121ºC ±1 durante 15 min.
Después de la esterilización los volúmenes
finales y el pH de la solución de trabajo deben ser iguales a los iniciales.
ii) Medios de cultivo
iii) Medio de Baird-Parker
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidad |
|
Medio base Punto
iv) del numeral 4.5.3.1 |
95,0 ml |
|
Solución
de telurito de potasio Punto v) del numeral 4.5.3.1 |
1,0 ml |
|
Emilsión
de yema de huevo Punto vi) del numeral 4.5.3.1 |
5,0 ml |
Preparación
Cuando el medio base esté a
45ºC, agregar los demás ingredientes y mezclar.
Colocar de 15 a 20 ml del medio
completo, enfriar y dejar solidificar.
Las placas pueden almacenarse
por 48 h a temperatura de 0 a 5ºC.
iv) Medio base de Baird-Parker
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidad |
|
Tripona |
10 g |
|
Extracto
de levadura |
1,0 g |
|
Extracto
de carne |
5,0 g |
|
Glicina |
12,0 g |
|
Cloruro
de litio |
5,0 g |
|
Piruvato
de sodio |
10,0 g |
|
Agar |
20,0 g |
|
Agua |
1,0 l |
Preparación
Disolver los ingredientes o el
agar base en agua y calentar con agitación constante y hervir durante 1 min.
Esterilizar a 121ºC ±1 durante 15 min.
Enfriar y mantener el medio a
45ºC.
v) Solución de telurito
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidad |
|
Telurito
de potasio |
1,0 g |
|
Agua |
100,0 ml |
Preparación
Disolver el telurito de potasio
en agua y esterilizar.
La solución puede ser
almacenada por varios meses a temperatura de 0 a 5ºC.
vi) Emulsión de yema
de huevo
Preparación
Lavar con agua y jabón los
huevos frescos que sean necesarios y limpiarlos con una solución de tintura de
yodo (solución alcohólica al 2%) o sumergirlos en solución de cloruro mercúrico
(1:1000). Enjuagar con agua estéril y secar con gasa estéril.
En campana de flujo laminar o en condiciones
asépticas, abrir los huevos y vaciarlos en un separador de claras estéril.
Transferir las yemas a una probeta hasta un volumen de 60 ml y completar a 90
ml con solución salina isotónica.
Verter la emulsión a un matraz Erlenmeyer con
perlas de vidrio estéril y agitar fuertemente para formar la emulsión.
Filtrar a través de gasa.
Las placas deben utilizarse dentro de las 48 h
siguientes a su preparación.
vii) Solución salina isotónica
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidad |
|
Cloruro de sodio |
0,85 g |
|
Agua |
100,0 ml |
Preparación
Disolver el ingrediente en agua y esterilizar
a 121ºC ±1 durante 15 min.
vii) Caldo de infusión cerebro-corazón (BHI)
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidad |
|
Infusión de cerebro de
ternera |
200,0 ml |
|
Infusión de corazón de res |
250,0 ml |
|
Peptona de gelatina |
10,0 g |
|
Cloruro de sodio |
5,0 g |
|
Fosfato disódico
dodecahidratado |
2,5 g |
|
Glucosa |
2,0 g |
|
Agua |
1,0 ml |
Preparación
Disolver los ingredientes en agua y calentar
ligeramente si es necesario.
Distribuir y esterilizar durante 15 min a
121ºC ±1.
iv) Acido desoxirribonucleico helicoidal de timo
de ternera.
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidad |
|
Acido desoxirribonucléico
helicoidal de timo de ternera o equivalente |
0,03 g |
|
Agar |
1,0 g |
|
Cloruro de calcio anhídro
(solución 0,01 M) (punto x del numeral 4.5.3.1) |
0,10 ml |
|
Cloruro de sodio |
1,0 g |
|
Azul de toluidina (solución
0,1 M) (punto x i del numeral 4.5.3.1) |
0,30 ml |
|
Tris-(hidroximetil-aminometano)
(Tris solución 0,05 M, pH 9) (punto xii del numeral
4.5.3.1) |
100 ml |
Preparación
Disolver los ingredientes, excepto el azul de
toluidina agitando hasta completar la disolución del ácido desoxirribonucleico
y calentar a ebullición.
Agregar el azul de toluidina. Distribuir en
frascos pequeños con tapón de hule. No es necesario esterilizar.
Este medio es estable a temperatura ambiente
hasta 4 meses y funciona perfectamente aun después de fundirlo varias veces.
Tomar un porta objetos limpio y agregar 3 ml
del medio fundido esparciéndolo por la superficie.
Cuando el agar solidifique, hacer orificios
con la punta de una pipeta Pasteur.
Conservar en refrigeración para evitar la
deshidratación.
x) Solución de cloruro de calcio anhidro 0,01 M
Cloruro de calcio PM = 110,99
Disolver 0,1199 g de cloruro de calcio en 100
ml de agua.
xi) Solución de azul de toluidina 0,1 M
Disolver 3,05 g de azul de toluidina en 100 ml
de agua.
xii) Solución amortiguadora 0,05 M
Tris-(hidroximetilaminometano)
(Tris pH 9) PM = 121,1
Disolver 6,055 g de Tris en 100 ml de agua.
xii) Reactivo biológico:
Plasma de conejo
Emplear plasma deshidratado o rehidratado de
conejo siguiendo las instrucciones del fabricante y agregar ácido
etilendiaminotetracético (EDTA) en solución al 0,1% en plasma rehidratado. Si
se utiliza plasma deshidratado diluir con agua estéril en proporción de 1:3.
Puede emplearse plasma de conejo liofilizado
adicionado de EDTA. No debe emplearse sangre citratada.
4.5.3.2
Materiales
Todos los instrumentos que se utilicen para
trabajar la muestra deben esterilizarse mediante horno, durante 2 h de
170-175ºC o como alternativa en autoclave durante 15 min como mínimo a 121ºC
±1.
Cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas,
espátulas y separador de huevo.
Tubos de cultivo de 16 mm x 150 mm o frascos
de 125 a 250 ml de capacidad.
Tubos de cultivo de 10 mm x 75 mm.
Cajas Petri de 90 a 100 mm de diámetro.
Pipetas bacteriológicas de 1 ml y 10 ml de
capacidad graduadas en 0,1 ml y 1 ml respectivamente y diámetro de 2 a 3 mm.
Pipetas Pasteur.
Probetas.
Varillas de vidrio de 3,5 mm de diámetro
aproximadamente y 20 cm de largo dobladas en ángulo recto.
Matraz Erlenmeyer con perlas de vidrio
Cámara húmeda: consiste en una caja Petri en
la cual se coloca una varilla de vidrio en forma de "V" rodeada de
algodón humedecido con agua.
4.5.4
Aparatos
Horno para esterilizar que alcance 180°C.
Autoclave con termómetro.
Baño de agua con regulador de temperatura de
35 ± 0,5ºC.
Baño de agua con regulador de temperatura de
45 ± 0,5ºC.
Balanza con capacidad no mayor de 2,500 g y
sensibilidad de 0,1 g.
Incubadora a 35 ± 1ºC.
4.5.5
Preparación de la muestra
La preparación de la muestra se debe realizar
de acuerdo a lo establecido en B.6.1 "Preparación
y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico".
4.5.6
Procedimiento
4.5.6.1
Utilizando diferentes pipetas
de 1 ml para cada dilución, depositar 0,1 ml sobre la superficie de las placas
de agar Baird-Parker.
4.5.6.2
Distribuir el inóculo sobre
la superficie del agar con varillas estériles de vidrio en ángulo recto,
utilizando una para cada dilución.
4.5.6.3
Mantener las placas en su
posición hasta que el inóculo sea absorbido por el agar.
4.5.6.4
Invertir las placas e incubar
de 45 a 48 h a 35ºC.
4.5.6.5
Seleccionar las placas que
tengan entre 15 y 150 colonias típicas de Staphylococcus
aureus; si no es posible, seleccionar las placas de las diluciones más
altas no obstante tengan más de 150 colonias.
4.5.6.6
Cuando las placas tengan
menos de 15 colonias típicas también pueden ser utilizadas y al informe se debe
agregar la nota de "valor estimado".
4.5.6.7
Las colonias típicas son
negras, circulares, brillantes, convexas, lisas, de diámetro de
4.5.6.8
Seleccionar las colonias de
acuerdo con el siguiente cuadro para realizar las pruebas de coagulasa y
termonucleasa:
CUADRO
|
Número de colonias sospechosas en caja |
Número de colonias por probar |
|
Menos de 50 |
3 |
|
51 a 100 |
5 |
|
101 a 150 o más |
7 |
4.5.6.9
Seleccionar el número de
colonias y sembrar cada una en tubos con 0,5 ml de caldo de infusión
cerebro-corazón.
4.5.6.10
Incubar a 35ºC durante 24 h.
4.5.6.11
Inocular en la misma forma
cepas conocidas de Staphylococcus aureus y
Staphylococcus epidermidis como
testigos positivo y negativo.
4.5.6.12
Después del periodo de
incubación pasar con una pipeta de 1 ml, 0,3 ml de cada cultivo a otro tubo de
10 mm x 75 mm y conservarlo para la prueba de termonucleasa. El resto del
cultivo se usa para la prueba de coagulasa.
4.5.6.13
Prueba de coagulasa
i) Agregar a los 0,2 ml del cultivo anterior,
0,2 ml de plasma de conejo diluido volumen a volumen con solución salina
estéril.
ii) Incubar en baño de agua de 35 a 37ºC y
observar durante 6 h a intervalos de 1 h; si no hay formación de coágulo,
observar a las 24 h. Considerar positiva la prueba si hay formación de coágulo.
Para comprobar la coagulabilidad del plasma de
conejo se añade una gota de cloruro de calcio al 5% a 0,5 ml de plasma
reconstituido empleado, formándose un coágulo en 10-15 seg.
4.5.6.14
Prueba de termonucleasa
i) Calentar durante 15 min, 0,3 ml de cultivo en
caldo de infusión cerebro-corazón en baño de agua hirviendo.
ii) Pasar una gota de cada cultivo por medio de
una pipeta Pasteur a un orificio del medio, incluye testigo.
iii)
Incubar a 35ºC en cámara
húmeda de 4 a 24 h.
iv) La aparición de un halo color rosa extendido
de por lo menos 1 mm alrededor de la perforación se califica como positiva.
4.5.7
Cálculo y expresión de
resultados
4.5.7.1
Cálculo
Hacer el cálculo del contenido de microorganismos
en el producto tomando en cuenta el número de colonias totales, el número de
colonias confirmadas, la dilución y el volumen inoculado (0,1 ml).
Ejemplo 1:
Si la caja tiene 80 colonias en la dilución
1:1000
Se toman 5 colonias para la prueba, de éstas dan
4 positivas, el cálculo es:
80 x 4 = 64 x 1000 x 10 = 640 000
5
Ejemplo 2:
Si la caja tiene 14 colonias en la dilución
1:10
Se toman 3 colonias para la prueba, de éstas
dan 2 positivas, el cálculo es:
14 x 2 = 9,3 x 10 x 10 = 930
3
4.5.7.2
Expresión de los resultados:
Según ejemplo 1:
Informar como Staphylococcus aureus 640 000 UFC/g
Según ejemplo 2:
Informar como Staphylococcus aureus 930 UFC/g valor estimado
Si las pruebas confirmativas resultan
negativas en todas las colonias probadas, informar como:
0 UFC/g en muestras directas
-10 UFC/g en muestras de dilución 1:10
-100 UFC/g en muestras de dilución 1:100
En la práctica los resultados pueden variar,
esto dependerá del técnico que trabaje el método y el grado de confiabilidad
del mismo, que en el 95% de los casos es de ± 16% a ± 52%.
4.6 Método para la cuenta de mohos y levaduras en
alimentos
4.6.1
Fundamento
El método se basa en inocular una cantidad
conocida de muestra de prueba en un medio selectivo específico, acidificado a
un pH 3,5 e incubado a una temperatura de 25 ± 1°C, dando como resultado el
crecimiento de colonias características para este tipo de microorganismos.
4.6.2
Reactivos y materiales
4.6.2.1
Reactivos
Los reactivos que a continuación se mencionan
deben ser de grado analítico y cuando se indique agua debe entenderse como agua
destilada.
i) Medios de cultivo.
Agar papa-dextrosa, comercialmente disponible
en forma deshidratada.
Preparación del medio de cultivo.
Seguir instrucciones del fabricante y después
de esterilizar, enfriar en baño de agua a 45 ± 1°C, acidificar a un pH de 3,5 ±
0,1 con ácido tartárico estéril al 10% (aproximadamente 1,4 ml de ácido
tartárico por 100 ml de medio). Después de adicionar la solución, mezclar y
medir el pH con potenciómetro. Dejar solidificar una porción del medio. Hacer
esto en cada lote de medio preparado. A fin de preservar las propiedades
gelificantes del medio, no calentar después de agregar el ácido tartárico.
4.6.2.2
Soluciones.
i) Solución reguladora de fosfatos (solución
concentrada)
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Fosfato de potasio monobásico |
34,0 g |
|
Agua |
1,0 l |
Preparación:
Disolver el fosfato en 500 ml de agua y
ajustar el pH a 7,2 con hidróxido de sodio 1 N.
Llevar a 1,0 l de agua.
Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Conservar
en refrigeración (solución concentrada).
Tomar 1,25 ml de la solución concentrada y
llevar a 1,0 l con agua (solución de trabajo).
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml según
se requiera.
Esterilizar a 121 ± 1°C durante 15 minutos.
ii) Solución estéril de ácido tartárico al 10%
|
Fórmula |
|
|
Ingredientes |
Cantidades |
|
Acido tartárico |
10 g |
|
Agua destilada |
100, ml |
Preparación:
Disolver el ácido en el agua y esterilizar a
121 ± 1,0°C por 15 minutos o por filtración a través de membrana de 0,45 ìm.
4.6.2.3
Materiales.
Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1
ml (o si es necesario de 1 ml y 2 ml), con tapón de algodón. Pueden utilizarse
pipetas graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total.
Cajas Petri.
Frascos de vidrio de 250 ml con tapón de
rosca.
Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca.
Utensilios esterilizables para la obtención de
muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas, etc.
Todo el material e instrumentos que tengan
contacto con las muestras bajo estudio, deben esterilizarse mediante:
Horno,
durante 2 h de
4.6.3 Aparatos e
instrumentos
Horno para
esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C.
Incubadora
con termostato que pueda ser mantenido a 25 ± 1,0°C provista con termómetro
calibrado.
Autoclave que alcance una temperatura mínima
de 121 ± 1,0°C.
Baño de agua con control de temperatura y
circulación mecánica, provista con termómetro calibrado con divisiones de 0,1°C
y que mantenga la temperatura a 45 ± 1,0°C.
Contador de colonias de campo oscuro, con luz
adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente amplificador.
Registrador
mecánico o electrónico.
Microscopio
óptico.
Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades
de pH a 25°C.
4.6.4
Preparación de la muestra
La preparación de la muestra debe ser de
acuerdo a lo señalado en el numeral 4.1 (Procedimiento para la preparación y
dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico) de este
apéndice normativo.
4.6.5
Procedimiento
4.6.5.1
Colocar por duplicado en
cajas Petri 1 ml de la muestra líquida directa o de la dilución primaria,
utilizando para tal propósito una pipeta estéril.
4.6.5.2
Repetir el procedimiento
tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar, utilizando una
pipeta estéril diferente para cada dilución.
4.6.5.3
Verter de 15 a 20 ml de agar
papa dextrosa acidificado, fundido y mantenido a 45 ± 1°C en un baño de agua.
El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el
momento en que es vertido el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.
4.6.5.4
Mezclar cuidadosamente el
medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el sentido de las
manecillas del reloj, seis en el sentido contrario y seis de atrás para
adelante, sobre una superficie lisa. Permitir que la mezcla se solidifique
dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie horizontal fría.
4.6.5.5
Preparar una caja control con
15 ml de medio, para verificar la esterilidad.
4.6.5.6
Invertir las cajas y
colocarlas en la incubadora a 25 ± 1°C.
4.6.5.7
Contar las colonias de cada
placa después de 3, 4 y 5 días de incubación. Después de 5 días, seleccionar
aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si alguna parte de la
caja muestra crecimiento extendido de mohos o si es difícil contar colonias
bien aisladas, considerar los conteos de 4 días de incubación y aún de 3 días.
En este caso, informar el periodo de incubación de 3 o 4 días en los resultados
del análisis.
4.6.5.8
Si es necesario, cuando la
morfología colonial no sea suficiente, examinar microscópicamente para
distinguir las colonias de levaduras y mohos de las bacterias.
4.6.6
Expresión de resultados
Cálculo del Método
Considerar las cuentas de placas con 10 a 150
colonias como las adecuadas para el informe.
Multiplicar por el inverso de la dilución,
tomando en consideración los criterios del numeral 4.2 de este apéndice (Método
para la cuenta de bacterias aerobias en placa), para la expresión de
resultados.
4.6.7
Informe de la prueba
Informar:
Unidades formadoras de colonias por gramo o
mililitro (UFC/g o ml) de mohos en agar papa dextrosa acidificado, incubadas
a 25 ± 1°C durante 5 días.
Unidades formadoras de colonias por gramo o
mililitro (UFC/g o ml) de levaduras en agar papadextrosa acidificado, incubadas
a 25 ± 1°C durante 5 días.
5
Método de prueba para la determinacion de cadmio, plomo, fierro y zinc en
productos objeto de esta norma alimentos por espectrometría de absorcion atómica.
5.1 Introducción
La presencia de ciertos elementos químicos en
alimentos, bebidas, agua potable y agua purificada, constituye un serio
problema para la salud del hombre debido a su toxicidad.
5.2 Fundamento
El método de absorción atómica se basa en
hacer pasar un haz de luz monocromática de una frecuencia tal que puede ser
absorbido por el analito que se encuentra presente en forma de vapor atómico.
La medida de la intensidad luminosa antes y después de su paso por el vapor
atómico permite determinar el porciento de absorción.
La cantidad de absorción aumenta con la
concentración de los átomos en el medio absorbente, es decir, la medida de la
absorción aumenta con la concentración del elemento en la muestra, ya sea que
esté en su condición original o sujeta a pretratamiento.
5.3 Reactivos y
materiales
5.3.1 Reactivos
Soluciones estándares de
referencia certificadas de cada uno de los metales.
Agua, debe ser destilada
deionizada, con un grado máximo de conductividad de 1 µmho/cm a 25ºC.
Acido nítrico (densidad
específica 1,41), grado suprapuro.
Acido nítrico (densidad
específica 1,41), contenido de mercurio muy bajo.
Acido perclórico (densidad
específica 1,67), grado suprapuro.
Acido clorhídrico (densidad
específica 1,19), grado suprapuro.
Acido sulfúrico (densidad
específica 1,84), grado suprapuro.
Acido sulfúrico 1 N a partir de
la solución grado suprapuro.
Acido nítrico 65% v/v grado RA.
Peróxido de hidrógeno (densidad
específica 1,12).
Hidróxido de sodio granalla
reactivo RA.
Aire comprimido seco y limpio.
Gases: acetileno, óxido nitroso,
argón y nitrógeno, grado absorción atómica.
Solución de Nitrato de Magnesio
hexahidratado al 7% p/v. Disolver 70 g de Mg(NO3)2
.6H2O en 1000 ml de HCl 1 N.
Acido clorhídrico 1 N. Diluir
8,3 ml de HCl y llevar a 100 ml de agua.
Acido nítrico al 50% v/v.
Diluir 50 ml de HNO3 al 65% v/v grado suprapuro en 50 ml de agua.
Acido clorhídrico 8 M. Diluir
66,0 ml de HCl y llevar a 100 ml con agua.
Acido clorhídrico 0,5 N. Diluir
4,15 ml de HCl y llevar a 100 ml con agua.
Solución de Yoduro de Potasio
al 15% p/v. Disolver 15 g de KI en 100 ml de agua (esta solución debe
prepararse en el momento de usarse).
Solución de Yoduro de Potasio
al 20% p/v. Disolver 20 g de KI en 100 ml de agua (esta solución debe
prepararse en el momento de usarse).
Solución de Cloruro de Potasio
(10 mg/ml de K). Disolver
Solución de Nitrato de Magnesio
al 50% p/v. Disolver 50 g de Mg(NO3)2.6H2O en 100 ml de agua.
Solución de ácido clorhídrico
al 1,5% p/v. Diluir 1,5 ml de HCl en 100 ml de agua destilada deionizada.
Solución de hidróxido de sodio
al 1% p/v. Pesar 1 g de hidróxido de sodio y diluir a 100 ml con agua destilada
deionizada.
Solución de borohidruro de
sodio al 4% p/v en solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Pesar 4 g de borohidruro
de sodio en 100 ml de una solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Filtrar al
vacio.
Solución reductora para
mercurio. Mezclar 50 ml de ácido sulfúrico concentrado con aproximadamente 300
ml de agua. Enfriar a temperatura ambiente y disolver 15 g de cloruro de sodio,
15 g de sulfato o cloruro de hidroxilamina y 25 g de cloruro o sulfato estanoso
en solución. Diluir a 500 ml.
Solución de dilución para
mercurio. En un matraz de 1 l, conteniendo de 300 a 500 ml de agua destilada
deionizada, agregar 58 ml de ácido nítrico concentrado de muy baja
concentración de mercurio y 67 ml de ácido sulfúrico concentrado. Diluir al
volumen con agua.
Solución de trabajo de As de 1
µg/ml. Diluir 1 ml de la solución patrón de 1000 µg/ml a 1 l con ácido
sulfúrico 1N preparada a partir de la solución grado suprapuro. Preparar fresca
cada día.
5.3.2 Materiales
Matraces Kjeldahl de 500 ml y
800 ml.
Sistema de reflujo con
refrigerante.
Crisoles Vycor de 40 a 50 ml de
capacidad.
Crisoles de platino de 40 a 50
ml de capacidad.
Matraces Erlenmeyer de
diferentes capacidades.
Matraces volumétricos de
diferentes capacidades.
Matraces redondos de fondo plano de 50 ml.
Bombas Parr.
Micropipetas o pipetas de Eppendorf de
diferentes capacidades.
Puntas de plástico para micropipetas.
Papel filtro Whatman No. 2.
Perlas de ebullición.
Varillas de plástico.
Tubos de ensayo graduados de propilen o
propileno de 15 ml.
Recipientes de propilen o propileno.
Embudos de filtración de diferentes
capacidades.
Material común de laboratorio.
Todo el material utilizado debe someterse a
lavado de acuerdo con las siguientes instrucciones.
El jabón que se use debe ser de preferencia
neutro.
Enjuagar perfectamente con agua corriente.
Sumergir el material de vidrio o plástico en
un recipiente (de preferencia plástico) que contenga una solución de ácido
nítrico grado RA al 30 %.
Dejarlo tapado y reposando por un lapso de 24
horas.
Quitar el exceso de ácido nítrico con varios
enjuagues (5 o 6 veces) con agua deionizada.
Dejar escurrir y secar.
Guardar en cuanto esté seco para evitar
contaminación por partículas en el aire.
5.4 Aparatos e instrumentos
5.4.1
Aparatos
Lámparas de cátodo hueco o de descarga sin
electrodos para determinar arsénico, cadmio, cobre, estaño, fierro, mercurio,
plomo y zinc.
Fuente de radiofrecuencia en caso de usar
lámparas de descarga.
Automuestreador y recirculador de agua.
Placa de calentamiento con regulador que alcance
una temperatura de 400 a 450ºC.
Horno de microondas.
Autoclave que alcance 121 ± 5ºC o 15 lb de
presión.
Centrífuga de laboratorio capaz de mantener
1600 rpm.
5.4.2
Instrumentos
Los instrumentos que a continuación se indican
deben estar calibrados y ajustados antes de su operación.
Espectrómetro de absorción atómica equipado
con los accesorios para flama, horno de grafito, generador de hidruros o vapor
frío, dependiendo del método a seguir.
Balanza analítica con sensibilidad de 0,1 mg.
Mufla capaz de mantener una temperatura de 550
± 10ºC.
Horno de calentamiento (estufa) con intervalo
de temperatura de 120 ± 5ºC.
5.5 Preparación de la muestra
5.5.1
Digestión para la
determinación de Cd, Fe, Pb y Zn.
5.5.1.1
Digestión por vía húmeda.
i) Pesar con precisión de ± 0,1 mg, una cantidad
apropiada de muestra.
Para la determinación por el método de
absorción por flama pesar como máximo 20 g de alimentos que contengan del 50 al
75% de agua y 10 g de alimentos sólidos o semisólidos. Limite el contenido de
grasa o aceite a un máximo de 4 g y el total de materia orgánica a 5 g.
ii) Añadir 10 ml de ácido nítrico concentrado y
dejar reposar toda la noche o iniciar directamente la digestión.
iii)
Usar matraz de Kjeldhal o
matraz conectado al sistema de refrigerantes.
iv) Calentar suavemente.
v) Digerir la muestra 3 horas o más tiempo si es
necesario (algunas muestras requieren la adición de mayor cantidad de ácido
nítrico) hasta la aparición del color traslúcido, si queda ámbar, adicionar
peróxido de hidrógeno gota a gota con
agitación continua (reacción exotérmica).
vi) Enfriar.
vii)
Recuperar, filtrar y llevar a
un volumen conocido en matraz volumétrico.
viii)
Correr un blanco de reactivos
y muestra fortificada por cada serie de digestión.
ix) Leer en el aparato de elección (espectrómetro
de absorción atómica por flama u horno de grafito).
5.5.1.2
Digestión por vía seca.
i) Pesar con precisión de ± 0,1 mg, una cantidad
apropiada de muestra.
Para la determinación por el método de
absorción por flama pesar como máximo,
ii) Añadir 10 ml de ácido nítrico concentrado y
dejar reposar toda la noche o iniciar directamente la digestión. En productos
con alta concentración de proteínas adicionar una solución de nitrato de
magnesio al 7,0% p/v y mezclar completamente, llevar a sequedad aproximadamente
durante 6 horas en estufa a una temperatura de 90 a 95ºC.
iii)
Colocar la muestra en una
mufla y elevar la temperatura lentamente de 2 a 4ºC por minuto hasta 350°C.
Mantener la temperatura hasta que cesen los humos.
iv) Elevar gradualmente la temperatura de 500 a
550ºC para evitar que la muestra se incinere y mantener esa temperatura durante
16 horas o toda la noche.
v) Apagar la mufla y dejar enfriar.
vi) Un segundo paso de calcinación puede ser
requerido para remover algunos residuos de carbón, mediante el siguiente
procedimiento:
Lavar las paredes del crisol con 2 ml de ácido
nítrico al 50%. Colocar la muestra en una placa de calentamiento puesta a 120ºC
para remover el exceso de ácido. Colocar la muestra en una mufla fría y elevar
la temperatura gradualmente de 500 a 550ºC, manteniéndola por el tiempo
necesario. Repetir este procedimiento cuantas veces sea necesario hasta que
quede libre de carbón remanente.
vii)
Disolver las cenizas
completamente en 5 ml de ácido clorhídrico 1N, transferir la muestra disuelta a
un tubo de propileno o a un matraz de volumen conocido, enjuagar el crisol con
dos alícuotas de 5 ml de ácido clorhídrico 1 N y transferir al mismo tubo o
matraz para obtener un volumen de 15 ml en el primero y llevar al aforo en el
segundo, tapar y mezclar, si existe presencia de partículas o materia
insoluble, filtrar en papel Whatman No. 2, antes de la determinación.
viii)
Correr un blanco de reactivos
y muestra fortificada por cada serie de digestión.
ix) Leer en el aparato de elección (espectrómetro
de absorción atómica: flama u horno de grafito).
5.5.2
Digestión para la
determinación de Cd, Pb, Fe y Zn por horno de microondas.
Pesar con precisión de ± 0,1 mg, 0,500 g como
máximo de muestra, añadir 6 ml de ácido nítrico concentrado y 2 ml de agua
oxigenada al 30%, cerrar perfectamente el envase de reacción y proceder según
el manual del fabricante.
5.6 Procedimiento
5.6.1
Espectrometría de absorción atómica
por flama.
5.6.1.1
Calibración. Es necesario
comprobar que se tiene una calibración inicial y periódica aceptable.
i) Se inicia la configuración operacional del
instrumento y en el sistema de adquisición de datos. Permitir un periodo no
menor a 30 minutos para el calentamiento de las lámparas de descarga sin
electrodos.
ii) Se debe verificar la estabilidad del
instrumento mediante el análisis de una solución estándar 20 veces más
concentrada que el límite de detección del instrumento (LDI) para el analito,
leída un mínimo de cinco veces y calculando la desviación estándar resultante,
la cual debe ser menor al 5%.
iii) El instrumento debe calibrarse para el
analito a determinar usando el blanco de calibración y los estándares de
calibración preparados a 3 o 4 niveles de concentración dentro del intervalo
dinámico de concentración del analito.
iv) Ajustar el instrumento a 0 con el blanco de
calibración. Introducir los estándares de calibración del analito de menor a
mayor concentración y registrar al menos tres réplicas de la absorbancia de
cada uno.
v) Elaborar una curva de calibración graficando
absorbancia en función de la concentración. Lo anterior puede llevarse a cabo
en equipos que se programan directamente, en los cuales sólo es necesario
introducir los estándares y marcar su concentración teórica.
5.6.1.2
Operación del instrumento.
El desempeño del instrumento se verifica
mediante el empleo de blancos de calibración, estándares de calibración y una
muestra de control de calidad (MCC).
i) Después de que se ha realizado la
calibración, se debe verificar que el instrumento trabaje adecuadamente para el
analito. Para ello se analiza una muestra de control de calidad. Si las
mediciones varían en ± 10% o más, al valor establecido para
ii) Para verificar que el instrumento no presenta
deriva, por cada 10 análisis se debe analizar el blanco de calibración. Si el
valor verdadero del analito difiere ± 10% o más, el instrumento debe
recalibrarse. Si el error persiste debe identificarse el problema y corregirse.
Si la matriz de la muestra es responsable de
la deriva o afecta la respuesta del analito puede ser necesario trabajar por
adiciones estándar.
iii)
La demostración de la
operatividad inicial del instrumento se hace estableciendo los límites de
detección del método (LDM) para el analito y el intervalo de calibración
lineal. Para determinar el LDM se usa un blanco de reactivos fortificado con
una concentración del analito equivalente de 2 a 5 veces el límite de detección
estimado. Se hacen al menos 4 réplicas de lectura de absorbancia del blanco de
reactivos fortificado procesado a través de todo el método analítico. Los LDM
se calculan de acuerdo a:
LDM= t x s
t = valor de la "T" de Student a un
intervalo de confianza de 99% y una desviación estándar estimada.
para n-1 grados de libertad. t = 3,14 para 7
réplicas.
s = desviación estándar de las réplicas del
análisis.
El intervalo lineal de calibración se
establece a partir de por lo menos 4 estándares de diferente concentración, uno
de los cuales debe estar próximo al límite superior del intervalo lineal.
5.6.1.3
Determinación
i) Ajustar el instrumento de absorción atómica
en las condiciones adecuadas para la determinación del analito de acuerdo a las
indicaciones del manual del instrumento.
ii) Introducir el blanco de reactivos y la muestra
a analizar y registrar los valores de absorbancia. Se debe analizar al menos un
blanco de reactivos con cada grupo de muestras. Los valores obtenidos ponen de
manifiesto la calidad de los reactivos usados y el grado de contaminación del
laboratorio.
iii)
En los equipos que pueden
programarse, la lectura obtenida da directamente la concentración del elemento
en las unidades de concentración utilizadas.
iv) Se debe analizar al menos un blanco de
reactivos fortificado para cada grupo de muestras. Se calcula la exactitud como
el porciento de recuperación (de acuerdo al punto vi del numeral 5.6.1.3).
v) Se debe fortificar al menos una muestra por
grupo o el 10% de ellas lo que resulte mayor. La concentración añadida debe ser de
aproximadamente 0,1 unidades de absorbancia.
vi) Se debe calcular el porciento de recuperación
para el analito, de acuerdo a:
CM - C
R =
-------------- x 100
CA
R = % recuperación
CM = Concentración de la muestra fortificada
C = Concentración de la muestra
CA = Concentración equivalente de analito
añadido a la muestra.
Si la recuperación del analito en la muestra fortificada
está fuera del intervalo previamente establecido y el blanco de reactivos
fortificado está correcto, puede existir un problema relacionado con la matriz
de la muestra. Los datos se deben verificar por el método de las adiciones
estándar.
5.6.2
Espectrometría de absorción
atómica por horno de grafito.
5.6.2.1
Calibración.
i) Proceder de acuerdo a los puntos i)
al iv) del numeral 5.6.1.1
ii) Elaborar una curva de calibración graficando
área de pico o altura máxima contra concentración del analito.
La calibración mediante el uso de una
computadora o una calculadora basada en el ajuste sobre los datos de
concentración respuesta es aceptada.
Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos
que se programan directamente, en los cuales sólo es necesario introducir los
estándares y marcar su concentración teórica.
5.6.2.2
Operación del instrumento.
i) Proceder de acuerdo a los puntos i) a iii) del
numeral 5.6.1.2
5.6.2.3
Determinación.
i) Ajustar el instrumento de absorción atómica en
las condiciones adecuadas para la determinación del analito, de acuerdo a las
recomendaciones del manual del instrumento.
El programa de temperaturas para el horno de
grafito puede variar dependiendo de la matriz de la muestra. En el caso de
existir interferencias no específicas (absorción molecular o dispersión de la
luz), se recomienda consultar la bibliografía existente en cuanto a los métodos
disponibles para eliminarlas, así como en el caso de interferencias de matriz.
5.6.3
Espectrometría de absorción
atómica por generador de hidruros.
5.6.3.1
Calibración.
i) Proceder de acuerdo a los puntos i) a iv) del numeral 5.6.
ii) A partir de la solución estándar de As de
1000 mg/l, preparar una solución de As de 1 mg/l en ácido clorhídrico de
concentración apropiada al método. Trazar una curva de calibración de
absorbancia (máximo de la altura de pico) en función de la concentración del
analito para un intervalo de concentración de
5.6.3.2
Operación del instrumento.
i) Proceder de acuerdo a los puntos i) a iii) del numeral 5.6.1.2
5.7 Expresión de resultados
Método de cálculo.
Interpolar los valores de absorbancia o altura
de pico de la muestra analizada en la curva de calibración y obtener los mg/kg
del elemento en la muestra y realizar los cálculos empleando la siguiente
fórmula:
A
x B
mg/ kg =
--------
C
en donde:
A = Concentración en mg/kg de la muestra a
interpolar en la curva de calibración.
B = Volumen final al que se llevó la muestra
(ml).
C = Peso de la muestra (g) o volumen de la
muestra (ml) en el caso de agua.
En los equipos que pueden programarse, la
lectura obtenida da directamente la concentración del elemento en mg/kg o
µg/kg.
5.8 Informe de la prueba
Los resultados se informarán en mg/kg o µg/kg
del elemento a determinar.
6
Determinación de Vitamina B1 y B2 por Cromatografía Líquida de Alta Resolución
(HPLC)
6.1 Fundamento
La vitamina B1, es extraída de la muestra por
hidrólisis ácida y oxidada a tiocromo, su contenido es determinado por HPLC en fase
inversa con detección fluorométrica.
6.2 Reactivos y
materiales
6.2.1 Reactivos
Acido clorhídrico fumante, 37%
para análisis (HCl).
Acetato de sodio trihidratado,
para análisis. (CH3 . CO2Na . 3H2O).
Acido orto-fosfórico PO4H3
(P2O5 . 3H2O).
Ferricianuro de potasio, para
análisis Fe(CN)6K4 . 3H2O.
Hidróxido de sodio en lentejas,
para análisis.
Monohidrato de tiamina (nitrato
de tiamina, Vitamina B1 monohidratada), calidad alimentaria (C12H17N5O4S).
Papaína soluble.
Amilasa.
Diastasa.
N,N - Dimetilformamida HCON(CH3)2.
fosfato, ácido de-potasio, para
análisis (K2HPO4 . 3H2O).
6.2.2 Materiales.
Matraces en forma de pera, 100
ml.
Tapones huecos hexagonales.
Matraces aforados, de vidrio de
1000, 100, 50 y 10 ml.
Embudos de vidrio de 100 mm de
diámetro.
Matraces Erlenmeyer, de cuello
estrecho, 250 ml.
Refrigerante, Allihn, manguito
300 mm.
Filtros plisados medianos 185
mm de diámetro.
Pipetas aforadas con una marca
de 2, 3, 5 y 40 ml.
Pipetas graduadas hasta la
punta de 1 ml: 0,005.
Probetas graduadas, en forma
alta, de 50 ml: 0,5; 100 ml: 1,0 1000 ml: 10,0
Todo el material de vidrio debe
ser actínico o forrado con papel aluminio.
6.2.3 Aparatos e
instrumentos
Balanza analítica, 162 g,
lectura 0,1 mg.
Balanza de precisión
electrónica, 2100 g, lectura 0,01 g.
Baño de agua en línea con
soportes, 6 plazas.
Estufa de laboratorio.
Jeringuilla para HPLC, de un 1
ml.
Aguja para jeringuilla.
Columna ODS o C 18, 5 µm, 250 X
4,6 mm; o equivalente.
Dispositivo de filtración sobre
membrana.
Membrana para filtro.
6.4 Preparación de
soluciones
6.4.1 Solución de
ácido clorhídrico
En un matraz aforado de 1000 ml
que contenga aproximadamente 500 ml de agua destilada, añadir con cuidado 82 ml
de ácido clorhídrico al 37% y llevar a volumen con agua destilada. Trabajar en
campana de extracción.
6.4.2 Solución de
acetato de sodio 2,5 M.
En un matraz aforado de 1000 ml
disolver
6.4.3 Hidróxido de
sodio, solución de 150 g/l.
En un matraz aforado de 1000
ml, disolver 160 g de hidróxido de sodio en lentejas en agua destilada, llevar
a volumen.
Conservar en un matraz provisto
de un tapón de polietileno.
6.4.4
Solución de oxidación
6.4.4.1
Solución de ferricianuro de
potasio 1g/100ml.
En un matraz aforado de 100 ml disolver,
6.4.4.2
Solución a preparar justo
antes del uso
En un matraz aforado de 50 ml, llevar a
volumen 2 ml de solución 6.4.4.1 con solución 6.4.3.
6.5 Fase móvil para HPLC
6.5.1
Solución de fosfato ácido
de-potasio, 10 mM pH 7,2.
En un vaso de 1000 ml pesar exactamente
6.5.2
Solución de dimetilformamida
al 15% en fosfato ácido de potasio.
En un matraz aforado de 1000 ml agregar 150 ml
de dimetilformamida y llevar a volumen con solución 6.5.1
6.6 Solución patrón de vitamina B1
6.6.1
Solución concentrada
En un matraz aforado de 50 ml de vidrio, pesar
exactamente 50,0 mg de monohidrato de tiamina y disolver en agua destilada.
Añadir 5 ml de ácido clorhídrico 1 N (6.4.1) y llevar a volumen con agua
destilada. Esta solución contiene 1 mg/ml.
6.6.2
Soluciones diluidas
En un matraz aforado de 50 ml, agregar
mediante una pipeta, 5 ml de solución 6.6.1 y llevar a volumen con agua
destilada. Luego verter mediante una pipeta, 5 ml de esta solución (100 µg/ml)
en un matraz aforado de 50 ml y llevar a volumen con agua destilada. Esta
solución contiene 10 µg/ml. Verter, mediante una pipeta, 5 ml de esta solución
en un matraz aforado de 50 ml y llevar a volumen con agua destilada. Esta solución
contiene 1 µg/ml.
6.6.3
Preparar de la misma manera
solución concentrada de riboflavina y de manera subsecuente las soluciones
diluidas. No es necesario utilizar matraces de vidrio.
6.6.4
Solución patrón oxidada para
HPLC
Mediante una pipeta, verter 5 ml de solución
6.6.2 en un matraz aforado de 10 ml de vidrio. Añadir 3 ml de solución de
ferricianuro de potasio básico (6.4.4.2). Agitar durante 2 minutos, añadir 0,45
ml de ácido fosfórico concentrado, mezclar, enfriar y llevar a volumen con agua
destilada. Cromatografiar esta solución inmediatamente.
6.7 Procedimiento
La vitamina B1 no es sensible a la luz; en
cambio el producto oxidado, el tiocromo, sí lo es. Durante la etapa de
oxidación, utilizar material de vidrio actínico, o material de vidrio corriente
protegido con papel aluminio.
6.7.1
Toma de ensayo
Homogeneizar toda la muestra, mezclando o
moliendo y pesar con una aproximación de 10 mg, una toma de ensayo de 5 g.
Para la determinación de vitamina B2 adicionar
0,5 g de amilasa y 0,25 g de papaína, independientemente de si el producto
contiene almidón o no.
6.7.1.1
Productos con almidón
En un matraz en forma de pera de 100 ml de
vidrio con cuello esmerilado, mezclar la toma de ensayo con 0,5 g de diastasa y
0,25 g de papaína. Añadir máximo 15 ml de agua destilada de 45-50 °C. Mezclar
bien, a fin de obtener una suspensión homogénea. Tapar el matraz y colocarlo
durante 30 min en una estufa a 40 °C.
Añadir a continuación 30 ml de agua destilada
de 45-50 °C.
6.7.2 Oxidación
En un matraz aforado de 10 ml
de vidrio verter, mediante una pipeta, 5 ml de solución (6.7.2.1 o 6.7.2.2). Añadir 3 ml de solución de
ferricianuro de potasio básico (6.4.4.2).
Agitar durante 2 minutos. Añadir 0,45 ml de ácido fosfórico concentrado,
mezclar, enfriar y llevar a volumen con agua destilada. Cromatografiar esta
solución inmediatamente.
6.7.3 HPLC
Condiciones
|
Columna: |
ODS o C
18, 5 µm; 250 X 4,6 mm o equivalente |
|
Loop de
inyección: |
50 µl |
|
Fase
móvil: |
ver
punto B.6.5.2 |
|
Caudal: |
1,5
ml/min |
|
*Detector:
espectrofluorímetro, excitación: |
368 nm |
|
|
emisión:
440 nm |
|
Registrador: |
10
mm/min |
*Para la determinación de
vitamina B2 se inyecta directamente del filtrado y se modifica la siguiente condición:
Detector: espectrofluorímetro;
excitación: 450 nm y emisión: 530 nm
Inyectar primero 50 µl de
solución patrón oxidada (B.7.6.4) y determinar el tiempo de retención: debe ser
de aproximadamente 5-6 min. A continuación inyectar 50 µl de la solución
obtenida B.7.7.3
6.8 Cálculo, expresión
e interpretación de los resultados
6.8.1 Evaluación
Identificar el pico del
tiocromo o de la riboflavina en el cromatograma de la toma de ensayo mediante
el tiempo de retención definido por cromatografía de la solución patrón. Medir
la altura de los picos obtenidos al cromatografiar la toma de ensayo y la
solución patrón. El contenido de vitamina B1, expresado en mg por
hp x C x V x 100
hs x m x1000
En donde:
m = masa de la toma de ensayo,
en g
hp = altura del pico del
extracto, en mm
hs = altura del pico de la
solución patrón, en mm
C = concentración de la
solución patrón, en µg/ml
V = volumen, en mililitros, en
el cual se ha diluido el extracto antes del análisis por HPLC (200 para estos productos)
6.8.2 Repetibilidad
La diferencia entre dos
resultados individuales obtenidos con la misma muestra para ensayo, en las
mismas condiciones (analista, aparato, laboratorio) en un corto intervalo de
tiempo, no debe exceder 10% de la media entre ambos resultados.
7 Determinación de Niacina. Método microbiológico
7.1 Fundamento
Este método permite cuantificar
concentraciones desconocidas de niacina utilizando Lactobacillus plantarum ATCC 8014, microorganismo que no puede
sintetizar esta vitamina, relacionando directamente el crecimiento celular con la concentración de niacina. Para preparar
la muestra y la curva estándar se utiliza un
medio libre de niacina y el crecimiento celular se cuantifica
turbidimétricamente. Por interpolación en la curva se determina la concentración de la muestra.
7.2 Reactivos y
materiales
7.2.1 Reactivos
Acido nicotínico para fines
bioquímicos.
Acido clorhídrico fumante 37%
para análisis.
Hidróxido de sodio en lentejas
para análisis.
Cristales de cloruro de sodio
para análisis.
7.2.2 Materiales
Micropipeta.
Vasos de precipitados.
Pipetas volumétricas.
Matraces Erlenmeyer.
Matraces volumétricos.
Tubos de ensaye.
7.3 Aparatos e
instrumentos
Autoclave.
Incubadora a 35°C ± 1°C.
Espectrofotómetro.
Centrífuga.
7.4 Cepa y medios de
cultivo
Lactobacillus plantarum ATCC
8014.
Leche descremada en polvo grado
reactivo.
Caldo micro inoculum.
Agar bacteriológico.
Caldo Bacto Lactobacilli.
Medio de prueba para niacina.
7.4.1 Medio de
mantenimiento de la cepa
Bacto Lactobacilli MRS-agar (MRS-agar)
Preparar 1 l de medio con 55 g
de caldo Bacto Lactobacilli MRS + 15 g de agar bacteriológico según las
indicaciones de la etiqueta del caldo MRS + 1,5% de leche descremada
(reconstituida al 10% en agua destilada). Repartir a razón de 6 ml en tubos (de
preferencia con tapón de rosca), esterilizar y enfriar en posición vertical.
Conservar en el refrigerador a
4°C.
7.4.2 Mantenimiento de
la cepa
Inocular por punción Lactobacillus plantarum en profundidad
en el medio 7.4.1 cada cuatro semanas, efectuar un cultivo intermedio de 18 h
en el medio líquido 7.4.3. Preparar el número de tubos necesarios para el
análisis y guardar por lo menos dos tubos para el mantenimiento de la cepa.
Incubar durante 18 h a 35°C.
7.4.3 Medio de cultivo
para el desarrollo del microorganismo
Caldo Micro Inoculum
Preparar 1 l de solución según
las indicaciones de la etiqueta y repartir a razón de 10 ml en tubos. Tapar los tubos con capuchones y esterilizar según las
indicaciones del fabricante. Conservar en el refrigerador a 4°C.
7.5 Preparación de
soluciones
7.5.1 Solución
fisiológica
Disolver 9 g de cloruro de sodio
en 1000 ml de agua destilada. Repartir a razón de 10 ml en tubos, taparlos con
capuchones y esterilizar durante 15 min a 121°C.
Conservar en el refrigerador a
4°C.
7.5.2 Solución de
ácido clorhídrico aproximadamente 1 N
Bajo una campana de extracción
diluir 82 ml de ácido clorhídrico al 37% llevándolos a un volumen de 1000 ml con agua destilada. Para ello verter
el ácido en el matraz aforado que ya contiene agua.
7.5.3 Solución de
Hidróxido de sodio 60 g/100 ml
Disolver 300 g de hidróxido de
sodio en agua destilada, enfriando bajo agua del grifo. Completar a 500 ml en
una probeta graduada. Conservar en un frasco con tapón de polietileno o de
goma.
7.5.4 Solución de
Hidróxido de sodio aproximadamente 1 N
Disolver 20 g de hidróxido de
sodio en agua destilada y llevar a volumen en un matraz aforado de 500 ml con
tapón de polietileno.
7.5.5 Solución patrón
Justo antes del uso, pesar
exactamente 50,0 mg de ácido nicotínico; disolver en agua destilada y llevar a
volumen en un matraz aforado de 500 ml.
7.6 Procedimiento
7.6.1 Desarrollo del
microorganismo
Un día antes subcultivar en 10
ml de caldo Micro Inoculum.
Incubar durante 18 h a 35°C.
Seis h antes de la inoculación del ensayo,
inocular 2 gotas (aproximadamente 0,1 ml) del último cultivo de 18 h en otro
tubo de 10 ml de caldo Micro Inoculum.
Incubar durante 6 h a 35°C.
7.6.2
Preparación de la toma de
ensayo
En un matraz Erlenmeyer de 150 ml, pesar de 1
a 3 g de muestra homogénea, que contenga aproximadamente 200 µg de vitamina,
añadir 50 ml de solución de ácido clorhídrico 1N en pequeñas cantidades pasando
el matraz Erlenmeyer bajo el grifo de agua caliente después de cada adición.
Cubrir el matraz con papel de aluminio y
colocarlo en el autoclave durante 15 min a 120°C. Enfriar.
Ajustar el pH a 4,6 añadiendo primero
aproximadamente 3 ml de hidróxido de sodio de 60 g/100 ml mientras se enfría el
matraz Erlenmeyer, y luego hidróxido de sodio 1 N. Transvertir
cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml y llevar a volumen con agua
destilada. Filtrar a través de un filtro plisado con velocidad de filtración
media.
Diluir el filtrado de modo que se obtenga una
solución de aproximadamente 0,05 µg de vitamina por ml.
7.6.3
Solución patrón, 0,05 µg/ml
Justo antes del uso diluir la solución 7.5.5
como sigue:
5 ml a 100 ml
10 ml a 100 ml
10 ml a 100 ml = 0,05 µg/ml
7.6.4
Medio de cultivo para el
ensayo
Medio de prueba para niacina
Preparar el volumen necesario en un matraz
Erlenmeyer de vidrio actínico de 100 ml. Proceder según las indicaciones de la
etiqueta, calentando la solución en una parrilla con agitación magnética.
Cálculo del volumen necesario:
patrón: 30 tubos 30 x 5 ml = 150 ml
cada producto: 10 tubos 10 x 5 ml = 50 ml
+ 50 a 100 ml de exceso
7.6.5
Preparación del ensayo
7.6.5.1
Serie patrón
En un soporte metálico para tubos de ensaye,
colocar tres filas de 10 tubos (180 x 18 mm), numerados bl, 0, ..., 8; el
primero corresponde al blanco (bl).
Mediante una pipeta verter en triplicado en
las tres series de tubos, volúmenes crecientes de la última dilución de la
solución patrón, completar a 5 ml con agua destilada y mediante una bureta o
una jeringa automática, añadir 5 ml de medio de cultivo para el ensayo según la
tabla siguiente:
|
Tubo No. |
bi |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
|
Sol. Patrón |
0,0 |
0,0 |
0,25 |
0,5 |
0,75 |
1,0 |
1,5 |
2,0 |
2,5 |
3,0 |
|
Agua |
5 |
5 |
4,75 |
4,5 |
4,25 |
4,0 |
3,5 |
3,5 |
3,5 |
2,0 |
|
Medio de cultivo |
5 ml en cada tubo |
|||||||||
Los tubos del ensayo en blanco (bl) no se
inoculan.
7.6.5.2
Serie producto
En otro soporte colocar dos filas de 10 tubos
(180 x 18 mm). Los primeros cinco tubos de ambas filas van destinados a un
producto, los otros cinco de ambas filas, a otro producto. Numerar de 9 a 13 y
de 14 a 18, y así sucesivamente para todos los productos analizados.
Mediante un pipeta verter
en duplicado en ambas series de cinco tubos, volúmenes crecientes de la última
dilución de la solución de la muestra, completar a 5 ml con agua destilada y
añadir 5 ml de medio de cultivo para el ensayo.
|
Tubo
No. |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
|
Sol. de la muestra: |
0,25 |
0,5 |
0,75 |
1,0 |
1,5 |
|
Agua |
4,75 |
4,5 |
4,25 |
4,0 |
3,5 |
|
Medio
de cultivo |
5 ml en cada tubo |
||||
Tapar los tubos con capuchones o mediante una tapa adecuada que cubra
ambas filas de tubos en el soporte.
7.6.6 Esterilización del ensayo
Esterilizar los tubos durante 15 min a 115°C, luego enfriarlos en un
baño de agua fría.
7.6.7 Inoculación
7.6.7.1 Preparación y estandarización del inóculo
Justo antes de inocular el ensayo, transvertir una cantidad suficiente
del cultivo preparado bajo 7.6.1 a un tubo de centrífuga estéril, centrifugar a
2600 rpm durante 5 min, decantar y resuspender el paquete celular en 10 ml de
solución salina. Hacer dos lavados más. Transvertir a una cubeta de 1 cm y
efectuar la lectura en el espectrofotómetro a 575 nm. Estandarizar el cultivo a
fin de obtener siempre aproximadamente la misma extinción. No debe olvidarse
sustraer de la extinción del cultivo la del medio de ensayo, que es un medio
coloreado.
Según la extinción, diluir "n" gotas del cultivo (7.6.1) en un tubo que contenga 10 ml de medio
(7.6.4). Este tubo es el inóculo.
Así pues, para una extinción del cultivo (7.6.1) entre 0,2 y 0,4
(después de sustraer la extinción propia del medio), introducir de 4 a 8 gotas
de cultivo en el tubo que contiene 10 ml de medio (7.6.4). Si la extinción no se encuentra en la zona arriba mencionada,
adaptar la dilución como sigue:
- extinción inferior a 0,2: introducir proporcionalmente más gotas en el
tubo (no más de 10 gotas).
- extinción superior a 0,4: introducir menos gotas o diluir
proporcionalmente con el medio (7.6.4).
7.6.7.2 Inoculación
Mediante una micropipeta con punta estéril, inocular 0,1 ml del inóculo
en cada tubo de las series patrón y producto. Los tubos del blanco (bl) no se
inoculan.
Después de inocular, agitar los tubos ligeramente a fin de repartir el
microorganismo uniformemente en el
medio.
7.6.8 Incubación
Incubar los tubos inoculados durante aproximadamente 16 h a 35°C.
Observar los tubos con regularidad al cabo de las 16 h. Verificar si la
diferencia de desarrollo del microorganismo es suficiente entre la primera y la
última dilución de la solución patrón.
Si es necesario, prolongar la incubación hasta que se obtenga un
crecimiento óptimo del microorganismo.
Después de la incubación se recomienda interrumpir el crecimiento del
microorganismo simultáneamente en todos los tubos, colocándolos en un baño de
agua fría.
7.6.9 Lecturas
Mediante un agitador para
tubos de ensaye, poner en suspensión el depósito formado por el desarrollo del
microorganismo. Transvertir la suspensión a un tubo o una cubeta óptica, según
el fotómetro. Medir la transmitancia o absorbancia a 575 nm ajustando el 100%
de T o a 0% de A del aparato con el blanco (bl).*
Agitar y leer un tubo
después de otro, a fin de evitar la sedimentación del microorganismo.
* Nota: Si la
determinación se hace en absorbancia buscar el equivalente de los valores de
los ejemplos, dados en transmitancia.
7.7 Cálculos
7.7.1 Curva de
calibración
Trazar la curva de
calibración en papel milimétrico, o utilizar una calculadora con regresión
lineal, llevando la lectura media de cada grupo de tres tubos a la ordenada y
los µg de vitamina a la abscisa.
Ejemplo:
|
Tubo |
ml |
mg |
Lecturas
|
media
No. |
||
|
|
|
|
1 |
2 |
3 |
|
|
0 |
0,0 |
0,0 |
88,7 |
88,6 |
88,2 |
88,5 |
|
1 |
0,25 |
0,0125 |
73,4 |
72,6 |
71,1 |
72,4 |
|
2 |
0,5 |
0,025 |
62,1 |
61,5 |
62,6 |
62,1 |
|
3 |
0,75 |
0,0375 |
53,3 |
53,2 |
55,5 |
54,0 |
|
4 |
1,0 |
0,050 |
47,3 |
48,0 |
49,1 |
48,1 |
|
5 |
1,5 |
0,075 |
36,8 |
37,7 |
40,5 |
38,3 |
|
6 |
2,0 |
0,10 |
31,0 |
45,6 |
39,5 |
35,3 |
|
7 |
2,5 |
0,125 |
30,5 |
27,2 |
27,2 |
28,3 |
|
8 |
3,0 |
0,15 |
29,0 |
24,8 |
24,0 |
25,9 |
Observaciones:
La curva de calibración es
característica de cada vitamina. Es mejor cuanto mayor sea la parte que ocupa
la escala de transmisión.
Repetir el ensayo cuando la
curva de crecimiento esté mal desarrollada, esto puede deberse a la cepa o al
medio de cultivo para el ensayo; que deben verificarse por separado.
7.7.2 Contenido de
vitamina en el producto
La media de las lecturas de
cada par de tubos permite leer en la curva de calibración la cantidad de
vitamina y calcular su concentración en la última dilución de la muestra.
Ejemplo:
|
Tubo |
ml |
Lecturas |
media |
mg* |
mg/ ml No. |
|
|
|
|
1 |
2 |
|
|
|
|
9 |
0,25 |
(88) |
79,0 |
79,0 |
0,0145 |
0,058 |
|
10 |
0,5 |
59,2 |
58,2 |
58,7 |
0,0300 |
0,060 |
|
11 |
0,75 |
52,0 |
52,2 |
52,1 |
0,0413 |
0,055 |
|
12 |
1,0 |
43,8 |
45,8 |
44,8 |
0,0580 |
0,058 |
|
13 |
1,5 |
35,0 |
35,5 |
35,3 |
0,086 |
0,057 |
Media 0,0576
(c)
( ) = valor aberrante
* = valores leídos en la curva
de calibración
Observación:
Fluctuaciones pequeñas en los
valores de la última columna son prueba de un buen ensayo.
Calcular el contenido de
vitamina en mg/100 g de producto, teniendo en cuenta las diluciones sucesivas y
la concentración en la muestra diluida.
El contenido de vitamina, expresado
en mg de ácido nicotínico por 100 g de producto es igual a:
C x V3 x V1 x 100
m x V2 x 1000
Donde:
C = media de las
concentraciones leídas en la curva de calibración, en µg/ml
V1 =
volumen en el que se ha disuelto la toma de ensayo, en ml
V2 =
parte alícuota de V1 en ml
V3 =
volumen al que se ha diluido la parte alícuota V2, en ml
m = toma de ensayo, en g
Ejemplo:
2,072 g (m) de producto se han
pesado en un matraz aforado de 100 ml (V1). Se ha tomado una
parte alícuota de 2 ml (V2), que se ha diluido en un matraz aforado de
100 ml (V3).
La media de las concentraciones
de niacina leídas en la curva de calibración es 0,0576 µg/ml (C).
El contenido de vitamina es:
0,0576 x 100 x 100 x 100_ = 13,9 mg/100 g
2,072 x 2 x 1000
8 Determinación de ácido fólico. Método microbiológico.
8.1 Fundamento
Este método permite cuantificar
ácido fólico utilizando Lactobacillus
casei ATCC 7469, microorganismo que no puede sintetizar esta vitamina,
relacionando directamente el crecimiento celular con la concentración de folato
presente. Para preparar la muestra y la curva estándar se utiliza un medio
comercial libre de folato.
El crecimiento celular se mide
turbidimétricamente y por interpolación en la curva se determina la
concentración en la muestra.
8.2 Reactivos y
materiales
8.2.1 Reactivos
Cloruro de calcio fundido o
granulado para análisis.
Fosfato diácido de potasio
anhidro.
Fosfato ácido di-potásico
anhidro.
Hidróxido de sodio en lentejas
para análisis.
Cristales de cloruro de sodio
para análisis.
Alcohol etílico absoluto.
α-amilasa.
Lactosa.
8.2.2 Materiales
Matraz Erlenmeyer de vidrio de
250 ml.
Matraz aforado de vidrio de
100, 250 y 500 ml.
Tapones de vidrio.
Micropipetas.
Material común de laboratorio.
Todo el material de vidrio debe
ser actínico o forrado con papel aluminio.
8.3 Aparatos e
instrumentos
Autoclave.
Incubadora a 35°C ± 1°C.
Espectrofotómetro.
Centrífuga.
8.4 Cepa y medios de
cultivo
Lactobacillus casei ATCC
7469.
Leche descremada en polvo grado
reactivo.
Caldo Micro Inoculum.
Agar bacteriológico.
Caldo Bacto Lactobacilli MRS.
Medio de prueba para ácido
fólico.
8.4.1 Medio de
mantenimiento de la cepa.
Bacto Lactobacilli MRS-agar (MRS-agar).
Preparar 1 l de medio con 55 g
de caldo Bacto Lactobacilli MRS + 15 g de agar bacteriológico, según las
indicaciones de la etiqueta del caldo MRS + 1,5% de leche descremada
(reconstituida al 10% en agua destilada). Repartir a razón de 6 ml en tubos (de
preferencia con tapón de rosca), esterilizar y enfriar en posición vertical.
Conservar en el refrigerador a
4°C.
8.4.2 Mantenimiento de
la cepa
Inocular por punción Lactobacillus casei en profundidad en el
medio 8.4.1 cada cuatro semanas, efectuando un cultivo intermedio de 18 h en el
medio líquido 8.4.3. Preparar el número de tubos necesarios para el análisis y
guardar por lo menos dos tubos para el mantenimiento de la cepa.
Incubar durante 18 h a 35°C.
8.4.3 Medio de cultivo
para el desarrollo del microorganismo
Caldo Micro Inoculum
Preparar 1 l de solución según
las indicaciones de la etiqueta y repartir a razón de 10 ml en tubos. Tapar los
tubos con capuchones y esterilizar según las indicaciones del fabricante.
Conservar en el refrigerador a
4°C.
8.5 Preparación de
soluciones
8.5.1 Solución
fisiológica
Disolver 9 g de cloruro de
sodio en 1000 ml de agua destilada. Repartir a razón de 10 ml en tubos,
taparlos con capuchones y esterilizar durante 15 min a 121°C.
Conservar en el refrigerador a
4°C.
8.5.2 Solución tampón
pH 6,1
Disolver 2 g de hidróxido de
sodio en agua destilada y llevar a volumen en un matraz aforado de 500 ml con
tapón de polietileno.
8.5.3 Solución de
cloruro de calcio, CaCl2, al 2%
Disolver 2 g de cloruro de
calcio en agua destilada y completar a 100 ml en un matraz aforado.
8.5.4 Solución patrón
Pesar exactamente 50,0 mg de
ácido fólico (ácido pteroilglutámico), disolver en agua destilada en un matraz
aforado de vidrio de 500 ml, añadir 50 ml de NaOH 0,1 N, 100 ml de alcohol y
llevar a volumen con agua destilada.
Conservar esta solución a 4°C
durante máximo 6 meses.
8.6 Procedimiento
El ácido fólico es fotosensible.
Por lo tanto, para todas las soluciones que contienen dicha vitamina se debe
utilizar material de vidrio actínico o cubrir el material de vidrio corriente
con papel de aluminio o un paño negro.
8.6.1 Desarrollo del
microorganismo
Un día antes, subcultivar en 10
ml de caldo Micro Inoculum (8.4.3).
Incubar durante 18 h a 35°C.
Seis horas antes de la
inoculación del ensayo, inocular 2 gotas (aproximadamente 0,1 ml) del último
cultivo de 18 h en otro tubo de 10 ml de caldo Micro Inoculum.
Incubar durante 6 h a 35°C.
8.6.2 Preparación de
la toma de ensayo
8.6.2.1 Productos sin
almidón
En un matraz Erlenmeyer de 250
ml, pesar de 1 a 3 g de muestra homogénea, que contenga aproximadamente 1 µg de
ácido fólico. Disolver en 30 ml de solución tampón pH 6,1 (8.5.2). A fin de
evitar la formación de grumos, añadir la solución tampón en pequeñas cantidades
pasando el matraz Erlenmeyer bajo el grifo de agua caliente.
Cubrir el matraz con papel de
aluminio y colocar en el autoclave durante 20 min a 102°C. Enfriar.
Transvertir cuantitativamente a
un matraz aforado de vidrio de 100 ml. Añadir al contenido del matraz 0,8 ml de solución de cloruro de calcio al 2%
y agitar. Dejar reposar durante 15 minutos, luego llevar a volumen con agua
destilada. Filtrar a través de un filtro plisado con velocidad de filtración
media.
Diluir el filtrado de modo que
se obtenga una solución de aproximadamente 0,2 ng de ácido fólico por ml.
8.6.2.2 Productos con
almidón
Proceder según el primer
apartado bajo 8.6.2.1.
Antes de colocar la solución en
el autoclave, añadir una cantidad de mezcla al 6% de α-amilasa pancreática
en lactosa, correspondiente a 1% de la toma de ensayo.
Incubar durante 30 min a 42°C.
Cubrir el matraz con papel de aluminio y colocar en el autoclave durante 20 min
a 102°C. Enfriar. A continuación transvertir cuantitativamente a un matraz
aforado de vidrio de 100 ml y proseguir como se describe en 8.6.2.1
Nota: Con cada nuevo lote de diastasa efectuar un ensayo en blanco.
Mediante una pipeta tomar 10 ml de solución patrón (8.6.3) dilución d.
Añadir 30 ml de agua. Añadir 100 mg de mezcla al 6% de α-amilasa
pancreática en lactosa. Incubar durante 30 min a 42°C. Transvertir
cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml. Llevar a volumen y filtrar.
La curva de calibración obtenida con esta solución debe ser comparable a
aquella obtenida con la solución patrón no tratada.
8.6.3 Solución patrón 0,2 ng/ml
Justo antes del uso diluir la solución 8.5.4 como sigue:
10 ml a 100 ml
10 ml a 100 ml
2 ml a 100 ml
10 ml a 100 ml
10 ml a 100 ml = 0,2 ng/ml
8.6.4 Medio de cultivo para el ensayo
Medio para prueba de ácido fólico.
Preparar el volumen necesario en un matraz Erlenmeyer de vidrio de 1000
ml. Proceder según las indicaciones de la etiqueta, calentando la solución en
una parrilla con agitación magnética.
Cálculo del volumen necesario:
patrón: 30 tubos 30 x 5 ml = 150 ml
cada producto: 10 tubos 10 x 5 ml = 50 ml
+ 50 ml a 100 ml de exceso
8.6.5 Preparación del ensayo
8.6.5.1 Serie patrón
En un soporte metálico para tubos de ensaye, colocar 3 filas de 10 tubos
(180 x 18 mm), numerados bl, 0,..., 8; el primero corresponde al blanco.
Mediante una pipeta vertir en triplicado en las tres series de tubos,
volúmenes crecientes de la última dilución de la solución patrón, completar a 5
ml con agua destilada y mediante una bureta o una jeringa automática, añadir 5
ml de medio de cultivo para el ensayo según la tabla siguiente:
|
Tubo No.: bi |
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
|
Sol. Patrón: 0,0 |
0,0 |
0,25 |
0,50 |
0,75 |
1,0 |
1,5 |
2,0 |
2,5 |
3,0 ml |
|
Agua: 5 |
5,0 |
4,75 |
4,5 |
4,25 |
4,0 |
3,5 |
3,0 |
2,5 |
2,0 |
|
Medio de cultivo |
5 ml en cada tubo |
||||||||
Los tubos del ensayo en blanco (bl) no se inoculan.
8.6.5.2 Serie producto
En otro soporte colocar dos filas de 10 tubos (180 x 18 mm). Los
primeros cinco tubos de ambas filas van destinados a un producto, los otros
cinco de ambas filas, a otro producto. Numerar de 9 a 13 y de 14 a 18 y así
sucesivamente para todos los productos analizados.
Mediante una pipeta verter en duplicado en ambas series de cinco tubos,
volúmenes crecientes de la última dilución de la solución de la muestra,
completar a 5 ml con agua destilada y añadir 5 ml de medio de cultivo para el
ensayo.
|
Tubo No. 9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
|
Sol. de la muestra: 0,25 |
0,5 |
0,75 |
1,0 |
1,5 ml |
|
Agua: 4,75 |
4,5 |
4,25 |
4,0 |
3,5 |
|
Medio de cultivo |
5 ml en cada tubo |
|||
Tapar los tubos con capuchones o mediante una tapa adecuada que cubra
ambas filas de tubos en el soporte.
8.6.6 Esterilización
del ensayo
Esterilizar los tubos
durante 10 min a 121°C, luego enfriarlos en un baño de agua fría.
8.6.7 Inoculación
8.6.7.1 Preparación y
estandarización del inóculo
Justo antes de inocular
el ensayo, transvertir una cantidad suficiente del cultivo preparado bajo 8.6.1
a un tubo de centrífuga estéril, centrifugar a 2600 rpm durante 5 min, decantar
y resuspender el paquete celular en 10 ml de solución salina. Hacer dos lavados
más. Transvertir a una cubeta de 1 cm y efectuar la lectura en el
espectrofotómetro a 575 nm. Estandarizar el cultivo a fin de obtener siempre
aproximadamente la misma extinción. No debe olvidarse sustraer de la extinción
del cultivo la del medio de ensayo, que es un medio coloreado.
Según la extinción,
diluir "n" gotas del cultivo (B.8.6.1) en un tubo que contenga 10 ml
de medio (8.6.4). Este tubo es el inóculo.
Así pues, para una
extinción del cultivo (8.6.1) entre 0,40 y 0,60 (después de sustraer la
extinción propia del medio), introducir 5 gotas de cultivo en el tubo que
contiene 10 ml de medio (8.6.4). Si la extinción no se encuentra en la zona
arriba mencionada, adaptar la dilución como sigue:
- extinción inferior a
0,40: introducir proporcionalmente más gotas en el tubo (no más de 10 gotas).
- extinción superior a
0,60: introducir menos gotas o diluir proporcionalmente con el medio (8.6.4).
8.6.7.2 Inoculación
Mediante una micropipeta
de punta estéril, inocular 0,1 ml del inóculo en cada tubo de las series patrón
y producto. Los tubos del blanco (bl) no se inoculan.
Después de inocular,
agitar los tubos ligeramente a fin de repartir el microorganismo uniformemente
en el medio.
8.6.8 Incubación
Incubar los tubos
inoculados durante aproximadamente 19 h a 35°C. Observar los tubos con regularidad
al cabo de las 19 h. Verificar si la diferencia de desarrollo del
microorganismo es suficiente entre la primera y la última dilución de la
solución patrón.
Si es necesario,
prolongar la incubación hasta que se obtenga un crecimiento óptimo del microorganismo.
Después de la incubación
se recomienda interrumpir el crecimiento del microorganismo simultáneamente en
todos los tubos, colocándolos en un baño de agua fría.
8.6.9 Lecturas
Mediante un agitador para
tubos de ensaye, poner en suspensión el depósito formado por el desarrollo del
microorganismo. Transvertir la suspensión a un tubo o una cubeta óptica, según
el fotómetro. Medir la transmitancia o absorbancia a 575 nm ajustando el 100%
de T o a 0% de A del aparato con el blanco (bl).
Agitar y leer un tubo
después de otro, a fin de evitar la sedimentación del microorganismo.
8.7 Cálculos
8.7.1 Curva de
calibración
Trazar la curva de
calibración en papel milimétrico o mediante una calculadora con regresión
lineal, llevando la lectura media de cada grupo de tres tubos a la ordenada y
los ng de ácido fólico a la abscisa.
*Nota: Si la
determinación se hace en absorbancia buscar el equivalente de los valores de
los ejemplos, dados en transmitancia.
Ejemplo:
|
Tubo
|
ml |
ng |
Lecturas |
Media
No. |
||
|
|
|
|
1 |
2 |
3 |
|
|
0 |
0,0 |
0,0 |
88,1 |
87,6 |
87,5 |
87,7 |
|
1 |
0,25 |
0,05 |
78,4 |
78,5 |
79,5 |
78,8 |
|
2 |
0,50 |
0,1 |
70,5 |
70,4 |
71,3 |
70,7 |
|
3 |
0,75 |
0,15 |
64,1 |
64,6 |
64,6 |
64,4 |
|
4 |
1,0 |
0,2 |
58,9 |
59,6 |
59,3 |
59,3 |
|
5 |
1,5 |
0,3 |
50,8 |
51,3 |
51,4 |
51,2 |
|
6 |
2,0 |
0,4 |
44,7 |
44,1 |
45,5 |
44,8 |
|
7 |
2,5 |
0,5 |
39,7 |
39,7 |
38,2 |
39,2 |
|
8 |
3,0 |
0,6 |
35,6 |
36,1 |
35,2 |
35,6 |
Observaciones:
La curva de calibración es característica de
cada vitamina. Es tanto mejor cuanto mayor sea la parte que ocupa de la escala
de transmisión.
Repetir el ensayo cuando la curva de
crecimiento esté mal desarrollada, esto puede deberse a la cepa o al medio de
cultivo para el ensayo; que deben verificarse por separado.
8.7.2
Contenido de vitamina en el
producto
La media de las lecturas de cada par de tubos
permite leer en la curva de calibración la cantidad de vitamina y calcular su
concentración en la última dilución de la muestra.
Ejemplo:
|
Tubo |
ml |
Lecturas |
media |
ng* |
Ng/ml N° |
|
|
|
|
1 |
2 |
|
|
|
|
9 |
0,25 |
80,2 |
79,4 |
79,8 |
0,045 |
0,18 |
|
10 |
0,50 |
71,6 |
73,7 |
72,6 |
0,095 |
0,19 |
|
11 |
0,75 |
66,1 |
67,7 |
66,9 |
0,135 |
0,18 |
|
12 |
1,0 |
61,4 |
(56,5) |
61,4 |
0,185 |
0,185 |
|
13 |
1,5 |
53,7 |
52,1 |
52,9 |
0,280 |
0,187 |
( ) =
valor aberrante
* = valores leídos en la curva de calibración
Observación:
Fluctuaciones pequeñas en los valores de la
última columna son prueba de un buen ensayo.
Calcular el contenido de vitamina en µg/100 g
de producto, teniendo en cuenta las diluciones sucesivas y la concentración en
la muestra diluida.
El contenido de ácido fólico, expresado en
µg/100 g de producto es igual a:
C x V3 x V1 x 100
m x V2 x
1000
C= media de las concentraciones leídas en la
curva de calibración, en ng/ml
V1= volumen en el que se ha disuelto la toma
de ensayo, en ml
V2= parte alícuota de V1, en ml
V3= volumen al que se ha diluido la parte
alícuota V2, en ml
m = toma de ensayo, en g
Ejemplo:
1 g (m) de producto se han pesado en un matraz
aforado de 100 ml(V1). Se ha tomado una parte alícuota de 10 ml (V2),
que se ha diluido en un matraz aforado de 250 ml (V3).
La media de las concentraciones en ácido
fólico leídas en la curva de calibración es 0,184 ng/ml (C).
El contenido en ácido fólico es:
0,184 x
250 x 100 x 100 = 46 mg /100 g
1
x 10 x 1000
______________________