PROYECTO de Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-210-SSA1-2013, Productos y servicios PROYECTO de Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-210-SSA1-2013, Productos y servicios. Métodos de prueba microbiológicos. Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de microorganismos patógenos y toxinas microbianas.
Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.- Secretaría de Salud.
MIKEL ANDONI ARRIOLA PEÑALOSA, Presidente del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, con fundamento en los artículos 39, fracción XXI, de la Ley Orgánica de la Administración Pública Federal; 4o., de la Ley Federal de Procedimiento Administrativo; 3o., fracciones XXII y XXIV, 13, apartado A), fracciones I y II, 17 Bis, 194, fracción I, 195, 197, 199 y 214, de la Ley General de Salud; 38, fracción II, 40, fracciones I, III, VII, XI y XIII, 41, 47, fracción I y 52, de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 28 y 33, del Reglamento de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 4o., 15 y Quinto Transitorio, del Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios; 2o., Apartado C, fracción X y 36, del Reglamento Interior de la Secretaría de Salud, y 3, fracciones I, literal s) y II, y 10, fracciones IV y VIII, del Reglamento de la Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios; he tenido a bien ordenar la publicación en el Diario Oficial de la Federación del Proyecto de Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-210-SSA1-2013, Productos y servicios. Métodos de prueba microbiológicos. Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de microorganismos patógenos y toxinas microbianas.
El presente proyecto se publica a efecto de que los interesados, dentro de los siguientes 60 días naturales, contados a partir de la fecha de su publicación, presenten sus comentarios por escrito, en idioma español y con el sustento técnico suficiente ante el Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, sito en Oklahoma No. 14, colonia Nápoles, Delegación Benito Juárez, código postal 03810, México, Distrito Federal, teléfono 5080 5200, extensión 1333, fax 5511 1499, correo electrónico rfs@cofepris.gob.mx.
Durante el plazo mencionado, los documentos que sirvieron de base para la elaboración del proyecto estarán a disposición del público para su consulta en el domicilio del Comité.
PREFACIO
En la elaboración de la presente norma participaron las siguientes Instituciones y Organismos.
SECRETARÍA DE SALUD.
Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios.
RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PÚBLICA.
Laboratorio de Análisis de Riesgo del Distrito Federal.
Laboratorio Estatal de Salud Pública del Estado de Chiapas.
Laboratorio Estatal de Salud Pública de Tamaulipas.
Laboratorio Estatal de Salud Pública Coahuila.
Laboratorio Estatal de Salud Pública de Jalisco.
Laboratorio Estatal de Salud Pública de Tlaxcala.
Laboratorio Estatal de Salud Pública de Nayarit.
Laboratorio Estatal de Salud Pública de Sonora.
Laboratorio Estatal de Salud Pública de Sinaloa.
SERVICIOS DE SALUD DEL ESTADO DE PUEBLA.
Subdirección de Servicios Auxiliares de Diagnóstico y Tratamiento de los Servicios de Salud del Estado de Puebla.
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO.
Facultad de Química.
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL.
Laboratorio de Investigación y Asistencia Técnica de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas.
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN.
Facultad de Ciencias Biológicas.
CÁMARA NACIONAL DE LA INDUSTRIA DE LA LECHE.
Organismo Nacional de Normalización de Productos Lácteos, A.C.
RED DE TERCEROS AUTORIZADOS.
Analysis & Research Lab, S.A. de C.V.
Laboratorio de Especialidades Inmunológicas, S.A. de C.V.
Centro de Capacitación en Calidad Sanitaria, S.A. de C.V.
Centro Estatal de Laboratorios.
Laboratorios Valdés, S.A. de C.V.
Grupo Cencon Centro de Control, S.A. de C.V.
Centro de Diagnóstico Microbiológico, S.A. de C.V.
Microlab Industrial, S.A. de C.V.
Silliker México, S.A. de C.V. Unidad Querétaro.
Laboratorio Quibimex, S.A. de C.V.
Laboratorios de Especialidades Inmunológicas, S.A. de C.V.
Laboratorio de Control de Calidad de Aguas, Bebidas y Alimentos.
Laboratorio de Bioquímica y Genética de Microorganismos.
Laboratorio Bio-Tekax.
Laboratorios del Sureste Cencon-Baqin, S.A. de C.V.
Centro de Control Total de Calidades, S.A. de C.V.
Laboratorio Industrial de Control para Alimentos, S.A. de C.V.
ÍNDICE
1. Objetivo y campo de aplicación.
2. Referencias.
3. Definiciones.
4. Símbolos y abreviaturas.
5. Consideraciones generales.
6. Equipo.
7. Medios de cultivo.
8. Cepas de referencia
9. Concordancia con normas internacionales.
10. Bibliografía.
11. Vigilancia de la norma.
12. Vigencia.
13. Apéndices.
Apéndice Normativo A. Método de referencia para el aislamiento de Salmonella spp.
Apéndice Normativo B. Método de referencia para la estimación de la cuenta de Staphylococos aureus.
Apéndice Normativo C. Método de referencia para el asilamiento Listeria monocitogenes.
Apéndice Normativo D. Método aprobado para el recuento de Enterococos en agua.
Apéndice Normativo E. Método de referencia "Sustrato fluorogénico para determinar enterococos en agua".
Apéndice Normativo F. Método aprobado para la determinación de Enterococos fecales en agua técnica de filtración por membrana.
Apéndice Normativo G. Método aprobado para el monitoreo de Enterococos fecales recomendado para el monitoreo de aguas para uso recreativo.
Apéndice Normativo H. Método aprobado para la estimación de la densidad de Coliformes Fecales y Escherichia coli por la técnica del número más probable presentes en muestras de alimentos para consumo humano y agua.
Apéndice normativo I. Método aprobado para la estimación de la densidad de Escherichia coli por la técnica del número más probable, para productos de la pesca.
1. Objetivo y campo de aplicación.
1.1. Esta Norma tiene por objeto establecer los métodos generales de prueba y alternativos para la determinación de los siguientes indicadores microbianos y patógenos en alimentos y agua para uso y consumo humano que no cuentan con una norma específica de producto:
- Salmonella spp.
- Apéndice Normativo A.
- Staphylococus aureus.
- Apéndice Normativo B.
- Listeria monocitogenes
- Apéndice Normativo C.
- Enterococos.
- Apéndice Normativo D.
- Apéndice Normativo E.
- Apéndice Normativo F.
- Apéndice Normativo G.
- Coliformes.
- Apéndice Normativo H.
- Escherichia coli.
- Apéndice Normativo H.
- Apéndice Normativo I.
1.2. Esta Norma es de observancia obligatoria en el territorio nacional para las personas físicas o morales que se dedican a efectuar los métodos a que se refiere el numeral anterior en alimentos para consumo nacional o de importación.
2. Referencias.
2.1. Norma Oficial Mexicana NOM-008-SCFI-2002. Sistema General de Unidades de Medida.
2.2. Norma Mexicana NMX-EC-17025-IMNC-2006. Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y de calibración.
3. Definiciones.
Para fines de esta Norma se entiende por:
3.1. Clostridium botulinum: al bacilo Gram positivo, anaerobio y formador de esporas, productor de una potente neurotoxina. Según la especificidad antigénica de la toxina producida por cada cepa, se conocen siete tipos diferentes: A, B, C, D, E, F y G.
3.2. Coliformes: a los bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos que a 32-35 °C fermentan la lactosa con formación de ácido y gas en un tiempo no mayor a 48 h.
3.3. Coliformes fecales: a los bacilos cortos Gram negativos, anaerobios facultativos, que fermentan la lactosa con producción de ácido y de gas a 45,5 ± 0,2 °C en 24 a 48 h.
3.4. Escherichia coli: al microorganismo que está presente en el intestino del hombre y animales de
sangre caliente, por lo que su presencia en una muestra de alimento no es deseable. Este microorganismo es miembro de la familia Enterobacteriaceae que incluye diferentes géneros de interés sanitario (Salmonella, Shigella y Yersinia, entre otras). La mayoría de los aislamientos de E. coli no son considerados como patógenos aunque pueden causar severas infecciones en personas inmunocomprometidas, en niños pequeños y ancianos. Ciertas cepas al ser ingeridas, pueden causar enfermedades gastrointestinales en individuos sanos. Produce ácido en agar que contenga 5-bromo-4-cloro-3-indol-b-D glucuronido y es b-glucuronidasa positivo incubado a 44 ±1 °C por 22 ±1 °C.
3.5. Enterococos intestinales: al subgrupo de los Streptococcus que incluye Enterococcus faecalis, E. faecium, Enterococcus durans y Enterococcus hirae. Son cadenas cortas o en pares de cocos Gram positivos, anaerobios facultativos, inmóviles, catalasa negativos. Al desarrollarse en los medios adecuados son capaces de reducir el 2, 3, 5â trifeniltetrazolio e hidrolizar la esculina a 44 °C.
3.6. Colonias: al agrupamiento de células en forma de masas visibles, en un medio sólido que provienen teóricamente de una sola célula.
3.7. Dilución primaria: a la solución, suspensión o emulsión obtenida después de pesar o medir una cantidad del producto bajo examen y mezclarla con una cantidad de nueve veces en proporción de diluyente.
3.8. Diluciones decimales adicionales: a las suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un determinado volumen de la dilución primaria con un volumen de nueve veces un diluyente y que por repetición de esta operación con cada dilución así preparada, se obtiene la serie de diluciones decimales adecuadas para la inoculación de medios de cultivo.
3.9. Hemólisis: a la zona transparente alrededor de la colonia debida a la lisis total del eritrocito.
3.10. Levaduras: a los microorganismos cuya forma dominante de crecimiento es unicelular, no suelen formar filamentos. Poseen un núcleo definido y se multiplican por reproducción sexual o asexual, por gemación o por fisión transversal. La reproducción sexual cuando ocurre, es por medio de ascosporas contenidas en un saco o asca. Típicamente exhiben forma oval y algunas especies son cromógenas.
3.11. Listeria monocytogenes: al bacilo corto, Gram positivo, no esporulado, móvil, aerobio facultativos, -hemolítico, catalasa positivo, oxidasa negativo, capaz de crecer en condiciones de microaerofília.
3.12. Métodos de referencia: a los métodos utilizados en casos de controversia nacional o internacional y en ausencia de un método aprobado.
3.13. Métodos aprobados: a los métodos que pueden emplearse para fines de control, inspección, reglamentación o por un programa específico y para decisiones para la protección contra riesgos sanitarios.
3.14. Métodos alternativos aprobados: a los métodos que se encuentran referidos en las referencias internacionales como AOAC Internacional, AFNOR, ISO, FDA, CODEX, entre otras y que cuentan con validación internacional y verificación en el laboratorio de prueba, sólo pueden ser usados en el análisis del producto para el cual fue validado.
3.15. Mesofílico aerobio: al microorganismo capaz de crecer en presencia de oxígeno y cuya temperatura óptima de crecimiento se encuentra entre los 20 y 37 ºC.
3.16. Mohos: al grupo de hongos microscópicos; organismos pertenecientes al reino Fungí, que se caracterizan por estar formados de una estructura filamentosa con ramificaciones que se conocen con el nombre de hifas, el conjunto de hifas constituye el micelio, carecen de clorofila, se alimentan por absorción pudiendo propagarse por esporas o no, las paredes celulares pueden ser de queratina, celulosa o manana. Crecen formando colonias en un medio selectivo a 25-28 °C.
3.17. Micrococus: al género de bacterias Gram-positivas con células esféricas de diámetro comprendido entre 0,5 y 3 micrómetros que típicamente aparecen en tétradas. Micrococcus tiene una gruesa pared celular que puede abarcar tanto como el 50% del materia celular. Su genoma es rico en guanina y citosina (GC), típicamente en porcentaje del 65 al 75% de contenido Guanin-Citocina.
3.18. Muestra: al número de unidades tomadas de un lote, que han sido seleccionadas en forma aleatoria y cuyas características son lo más similar posible a las del lote que procede.
3.19. Patógeno: al microorganismo capaz de producir una enfermedad.
3.20. Psicrofílico: al microorganismo que exhibe una temperatura óptima de crecimiento a 5-7 ºC como máximo. Tiene la capacidad de crecer a 0 ºC.
3.21. Psicrotrófico: al microorganismo que exhibe una temperatura óptima de crecimiento inferior a 20 ºC, pero que puede desarrollarse a temperaturas de refrigeración.
3.22. Salmonella spp: al bacilo Gram negativo, aerobio o anaerobio facultativo, no esporulado, generalmente lactosa negativo y móviles. Es una bacteria patógena para el hombre y algunos animales.
3.23. Staphylococcus aureus: a los cocos de 0,8 a 1,2 µm, Gram positivo, anaerobio facultativo, no esporulado, inmóvil, catalasa positivo, capaz de producir toxinas y otras enzimas relacionadas con su patogenicidad.
3.24. Temperatura Ambiental: a la que oscila entre 18 °C y 27 °C.
3.25. Termofílico aerobio: al microorganismo capaz de crecer en presencia de oxígeno y cuya temperatura óptima de crecimiento se encuentra por encima de los 50 ºC.
3.26. Toxina: a la sustancia productora de efectos tóxicos secretada por las bacterias patógenas.
3.27. Unidades Formadoras de Colonias: al término que se utiliza para reportar la cuenta de colonias en placa, presuponiendo que cada colonia proviene de un solo microorganismo.
3.28. Vibrio cholerae: al bacilo Gram negativo, curvo, móvil, no esporulado, anaerobio facultativo, oxidasa positivo.
4. Símbolos y abreviaturas.
Cuando en esta Norma se haga referencia a los siguientes símbolos y abreviaturas se entiende por:
| ABE | Agar Bilis Esculina. |
| ADN | Ácido desoxirribonucleico. |
| ASB | Agar Sulfito de Bismuto. |
| ASPE | Agar Selectivo para Enterococos Pfizer. |
| AST | Agar Soya Tripticasa. |
| ATCC | Por sus siglas en inglés American Type Culture Collection. |
| AOAC Internacional | Por sus siglas en inglés Association of Analytical Communities. |
| AFNOR | Por sus siglas en francés Association Franaise de Normalisation. |
| | Beta. |
| BHI | Caldo Infusión Cerebro Corazón. |
| Caldo A-1 | Caldo de pre enriquecimiento para coliformes. |
| Caldo fraser | Caldo pre-enriquecimiento selectivo secundario. |
| Caldo freser medio | Caldo pre-enriquecimiento selectivo primario. |
| CCAyAC | Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura. |
| CENAM | Centro Nacional de Metrología. |
| cm | centímetro. |
| CIP | Por sus siglas en inglés Culture International Production. |
| CODEX | Por sus siglas en inglés Codex Alimentarius, Internacional Food Standards. |
| COFEPRIS | Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios. |
| CST | Caldo Soya Tripticaseina. |
| CTSYE | Caldo Triptona Soya con Extracto de Levadura. |
| °C | grados Celsius. |
| ° | grados. |
| EC | Caldo E. coli. |
| E. coli | Escherichia coli. |
| E. faecalis | Enterococcus faecalis. |
| E. faecium | Enterococcus fecalis. |
| EH | Agar Entérico de Hektoen. |
| EDTA | Ácido etilendiaminotetraacético |
| EMB-L | Agar Azul de Metileno de Levin. |
| FDA | Por sus siglas en inglés Foods and Drugs Administration. |
| g | gramos |
| GUD | beta-glucuronidasa. |
| h | hora. |
| ISO | Por sus siglas en inglés International Organization for Standardization. |
| ICMSF | Por sus siglas en inglés International Commission on Microbiological Specifications for Foods. |
| IMViC | Indol, Rojo de metilo, voges Proskauer, citrato. |
| 1/d | Inverso de la dilución. |
| KOH | Hidróxido de Potasio. |
| L | Litro. |
| ± | más menos. |
| > | mayor. |
| < | Menor. |
| LIA | Agar hierro y lisina. |
| L. monocytogenes | Listeria monocytogenes. |
| L. innocua | Listeria innocua. |
| L. ivanovii | Listeria ivanovii. |
| µm | micrómetro. |
| mL | mililitro. |
| mm | milímetro. |
| min | minuto. |
| MKTTn | Caldo de Muller-Kauffmann tetrationato novobiocina. |
| M | molar. |
| MMGB | Caldo Glutamato con Minerales Modificado. |
| MUG | 4-metilumbelliferyl-beta-D-glucurónido. |
| MU | 4-metilumbelliferona. |
| NaCl | Cloruro de Sodio. |
| Nm | nanómetro. |
| NCTC | Por sus siglas en inglés National Culture Type Collection. |
| N | Normal. |
| NMP | Número Más Probable. |
| ONPG | O-Nitrofenil -D-galactopiranosido. |
| PALCAM | Medio PALCAM para determinar Listeria. |
| PBS | Solución Salina fosfatada amortiguda. |
| RM | Rojo metilo. |
| TBGA | Agar bilis glucuronido. |
| TSI | Agar triple azúcar y Hierro. |
| TSYA | Agar triptona soya con extracto de levadura. |
| / | por. |
| % | por ciento. |
| pH | potencial de Hidrógeno. |
| R. Equi | Rhodococus equi. |
| Rpm | Revoluciones por minuto. |
| RVS | Medio de Rappaport-Vassiliadis con soya. |
| S. auresus | Staphylococcus aureus. |
| S. epidermidis | Staphylococcus epidermidis. |
| seg | segundo. |
| spp | especies plurales. |
| X | signo de multiplicación. |
| XLD | Agar Xilosa Lisina Desoxicolato. |
| UFC | Unidades Formadoras de Colonias. |
| UV | Ultravioleta. |
| VP | Voges â Proskauer. |
5. Consideraciones Generales.
5.1. Los laboratorios de prueba que realicen estas determinaciones o análisis deberán cumplir con los requisitos establecidos en la NMX-EC-17025-IMNC-2006 o su versión vigente.
5.2. Para obtener resultados reproducibles y por lo tanto significativos, es de suma importancia seguir fielmente y controlar cuidadosamente las condiciones en que se llevan a cabo estos métodos.
5.3. Para aquellos casos en los que las personas físicas o morales que soliciten la aprobación de los métodos que utilicen para fines de control, inspección o programa específico, la COFEPRIS, emitirá la autorización correspondiente en términos de las disposiciones jurídicas aplicables y conforme a lo dispuesto en las "Guías para la aprobación de métodos alternativos", disponibles para su consulta en el portal de internet http://www.cofepris.gob.mx.
6. Equipos.
6.1. Todos los equipos deberán estar incluidos en un programa de calibración, verificación mantenimiento, de acuerdo a las características del equipo.
6.2. Los potenciómetros deben tener una precisión de verificación mínima de ± 0,1 pH a 20 °C â 25 °C. Deben verificarse el día de uso con soluciones Buffer trazables al CENAM.
6.3. Las balanzas deberán ser verificadas el día de uso utilizando un marco de pesas calibrado o verificado.
6.4. Los equipos para incubación tales como incubadoras y baños de agua, deberán demostrar que pueden trabajar a los intervalos de temperatura indicados en los métodos, mediante un estudio de distribución, muestreando diferentes puntos de la cámara, durante un tiempo determinado, que asegure las condiciones de incubación de la prueba.
6.5. Cuando se indique el uso de un termómetro éste deberá estar dentro de un programa de calibración y verificación vigente.
6.6. Las autoclaves y hornos, que se utilicen para la esterilización de material y medios de cultivo, deberán contar con instrumentos de medición calibrados. Cada ciclo de esterilización debe estar controlado paramétricamente (temperatura y presión) y con indicadores biológicos o contar con un programa de monitoreo con indicadores biológicos, considerando la frecuencia de uso y las condiciones de mantenimiento. Como con indicadores biológicos. Es recomendable que el laboratorio cuente con ciclos de esterilización validados, con el propósito de demostrar la distribución y la penetración del calor.
6.7. Los equipos de incubación deberán contar con termómetros calibrados con división mínima de la mitad de la variación permitida al equipo, por ejemplo cuando se indique un variación de +/- 1 ºC, el termómetro deberá tener un división mínima de 0.5 ºC.
6.8. La calibración de los equipos deberá ser trazable a un patrón nacional (CENAM).
7. Medios de Cultivo.
7.1. Todos los medios de cultivo deberán usarse hasta haber aprobado el control de calidad adecuado para su uso, con excepción de los medios de cultivo que tengan como restricción el tiempo de uso, en esos casos los resultados del análisis no podrán ser emitidos hasta haber completado el control de calidad de los medios de cultivo.
7.2. Pueden utilizarse medios de cultivo preparados en el laboratorio por ingrediente, medios de cultivo preparados en polvo o listos para su uso, siempre que éstos cumplan con la Formulación descrita en el método.
7.3. Debe realizarse control de calidad lote a lote de preparación. Como referencia para el control de calidad de los medios de cultivo pueden utilizarse las normas internacionales ISO 11133-1 e ISO 11133-2, los procedimientos recomendados por el fabricante o conforme a lo dispuesto en las "Guías para la evaluación de medios de cultivo para análisis microbiológicos", disponibles para su consulta en el portal de Internet http://www.cofepris.gob.mx. Para los medios de cultivo preparados el control de calidad debe realizarse por cada remisión entregada.
7.4. Los reactivos a emplear en el método objeto de esta Norma deben ser grado analítico.
8. Cepas de referencia.
8.1. Las cepas control utilizadas deberán demostrar trazabilidad a una colección de microorganismos reconocida y deberá demostrar la pureza y viabilidad de las mismas.
9. Concordancia con normas internacionales.
Esta Norma es totalmente equivalente con las siguientes normas internacionales.
9.1. International Standard ISO 16649-3. Microbiological of food and animal feeding stuffs. Horizontal method for the enumation of b âglucuronidasa Escherichia coli positive. Part 3 number technique using 5-bromo-4-choloro -3-indolyl âb-Dglucuronido. First edition (2005).
9.2. International Standard ISO 7899-2 Water quality. Detection and enumeration of intestinal enterococci. Part 2: Membrane filtration method. (04-2000).
9.3. International Standard ISO 8199 Water quality. General guidance on the enumeration of micro-organisms by cultura. (06-2005).
9.4. International Standard ISO 11290 Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes. Part 1: Detection method. 1th Edition (1996).
9.5. International Standard ISO 6888. Microbiology â General guidance for enumeration of Staphylococcus aureus â colony count technique, 1th edition (05-1983).
9.6. International Standard ISO 6579 Microbiology of food and animal feeding stuffs â horizontal method for the detection of Salmonella spp. 4th edition (2002).
10. Bibliografía.
10.1. American Public Health Association. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 21th edition. Washington DC. (2005).
10.2. Peter Feng, Stephen D. Weagant, Michael A. Grant. Bacteriological Analytical Manual, Chapter 4, Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria, marzo 2012. http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManualBAM/ default.htm.
10.3. American Public Health Association. Compendium of methods for the microbiological examination of foods. 4th edition Washington DC. (2001).
10.4. American Public Health Association. Recommended Procedures for the Examination of Seawater and shellfish. 4th edition. Washington DC. (1970).
10.5. American Public Health Association. Standard Methods for the Examination of Dairy Products. 16th edition. Washington DC. (1992).
10.6. American Public Health Association. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 20th edition. Washington DC. (1998).
10.7. Food and Agriculture Organization of the United Nations. Manual of Food Quality Control Microbiological Analysis. 4 revisions (1992).
10.8. AOAC Official Methods of Analysis. Microbiological Methods. Capítulo 17. 18 ° Edición, (1995).
10.9. AOAC Official Methods of Analysis. Microbiological Methods. Capítulo 17. 18 ° Edición, (2007).
10.10. MacFadin. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica. Editorial Panamericana (2002).
10.11. American Public Health Association Standard Methods For the examination Of Water & Wastewater, Membrane Filter Techniques. 21th edition. Washington DC. (2005).
10.12. Directiva Europea relativa a la calidad de las aguas destinadas al consumo humano. 98/83/CE.
10.13. World Health Organization. Guidelines for Drinking-water Quality. Vol. 1, 3th Edition.
10.14. ASTM International Standard Test Method for Enterococci in water using Enterolert. D6503-99 (2009).
10.15. EPA US Method 1600: Enterococci in Water by Membrane Filtration Using membrane-Enterococcus Indoxyl--D-Glucoside Agar (mEI) (September 2002).
10.16. FDA U.S. Food and Drug Administration. National Shellfish Sanitation Program. Guide for the control of Molluscan Shellfish. Charpenter II. Growing Areas. Section IV. (2007).
10.17. FSIS USDA MLG 8.08 Isolation and identification of Listeria monocytogenes from red meat, poultry and egg products, and environmental samples.
10.18. Wallace H. Andrews, Andrew Jacobson, and Thomas Hammack Bacteriological Analytical Manual. Capítulo 5 Salmonella 8th revisión, (Noviembre 2011) http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/ LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManualBAM/default.htm.
10.19. NMX-EC-17025-IMNC-2006 "Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración".
10.20. International Standar ISO/TS 11133-1:2009 Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Guidelines on preparation and production of culture media -- Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory. (2009).
10.21. International Standar ISO/TS 11133-2:2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Guidelines on preparation and production of culture media -- Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media.
11. Vigilancia de la norma.
La vigilancia del cumplimiento de esta Norma corresponde a la Secretaría de Salud, a través de la Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios y a los gobiernos de las Entidades Federativas, en el ámbito de sus respectivas competencias.
12. Vigencia.
Esta Norma entrará en vigor a los 180 días naturales contados a partir del día siguiente de su publicación en el Diario Oficial de la Federación.
TRANSITORIOS
PRIMERO.- La entrada en vigor de la presente Norma deja sin efectos la Norma Oficial Mexicana NOM-143-SSA1-1995, Bienes y servicios. Método de prueba microbiológico para alimentos. Determinación de Listeria monocytogenes, publicada en el Diario Oficial de la Federación el 19 de noviembre de 1997.
SEGUNDO.- La entrada en vigor de la presente Norma deja sin efectos el Proyecto de Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-210-SSA1-2002, Productos y servicios. Métodos de prueba microbiológicos. Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de microorganismos patógenos y toxinas microbianas, publicada en el Diario Oficial de la Federación el 10 de septiembre de 2003.
Sufragio Efectivo. No Reelección.
México, D.F., a 23 de abril de 2013.- El Comisionado Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios y Presidente del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, Mikel
Andoni Arriola Peñalosa.- Rúbrica.
13. Apéndices.
Apéndice Normativo A.
Método de referencia para el aislamiento de Salmonella spp.
Este método es aplicable para la detección de Salmonella spp en productos para consumo humano, así como de áreas de producción y manejo de alimentos especialmente en productos donde las condiciones ambientales permiten la contaminación de estos productos por microorganismos de la familia Enterobacteriaceae.
A.1. INTRODUCCIÓN.
Los miembros del género Salmonella han sido muy estudiados como patógenos cuando se encuentran presentes en los alimentos. El control de este microorganismo depende en cierta medida del método analítico utilizado para su detección.
Este microorganismo fue inicialmente identificado en muestras clínicas y los métodos empleados para estos casos se adaptaron posteriormente para su detección en alimentos. Las modificaciones a los métodos consideraron dos aspectos principales, el primero es el debilitamiento o daño a las células bacterianas presentes en un alimento debido al proceso a que está sujeto (por ejemplo: tratamiento térmico, secado, etc.) y segundo, la variabilidad inherente a la naturaleza del producto bajo estudio.
La determinación de la presencia o ausencia de Salmonella spp, en cierta cantidad de masa o volumen específico de producto, se lleva a cabo acorde a lo descrito en el presente método, requiriendo 4 etapas sucesivas. Las cuales son:
- Etapa de pre-enriquecimiento,
- Enriquecimiento selectivo,
- Aislamiento en medios de cultivos selectivos y diferenciales; y
- Identificación bioquímica y confirmación serológica de los microorganismos.
Nota: Salmonella puede presentarse en pequeños números y en algunas ocasiones ir acompañada de una gran carga microbiana de otras enterobacterias u otras familias. Es por lo que se hace necesario el pre-enriquecimiento para permitir la detección de un número bajo y/o células estresadas de Salmonella spp.
A.2. EQUIPO.
A.2.1. Aparato de esterilización de calor húmedo y calor seco.
A.2.2. Incubadora capaz de operar a 37 °C ± 1 °C.
A.2.3. Baño de agua capaz de operar a 41,5 °C ± 1 °C o incubadora capaz de trabajar a 41,5 °C ± 1 °C.
A.2.4. Baño de agua capaz de operar a 45 °C ± 2 °C.
A.2.5. Baño de agua capaz de operar a 37 °C ± 1 °C.
A.2.6. Potenciómetro.
A.2.7. Balanza granataria con sensibilidad de 0,1g verificada el día de uso.
A.2.8. Homogeneizador peristáltico o licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato, con vasos esterilizables (vidrio o aluminio).
A.3. MATERIALES.
A.3.1. Asa de platino o níquel de aprox. 3mm de diámetro o 10ml.
A.3.2. Pipetas graduadas o pipetas automáticas, de diferentes capacidades 10mL, 5mL, graduadas respectivamente en divisiones de 0.5mL y 0.1mL protegidas con tapón de algodón.
A.3.3. Pipetas de 1mL, con graduaciones de 0.1mL o micropipetas calibradas y verificadas.
A.3.4. Matraces Erlenmeyer de 500mL y/o capacidad apropiada.
A.3.5. Cajas Petri estériles de vidrio o desechables de diámetro 15mm x 100mm y/o de un diámetro mayor 140mm.
A.3.6. Cucharas, bisturíes, cuchillos y pinzas.
A.3.7. Tubos de ensaye de 16 x 150mm y de 20 x 100mm o de capacidades adecuadas.
A.3.8. Gradillas para tubos de ensaye.
A.3.9. Mecheros Bunsen o Fisher.
Nota: El material desechable puede utilizarse como alternativa aceptable a la cristalería reutilizable si cumple las especificaciones adecuadas.
A.4. MEDIOS DE CULTIVO.
A.4.1. Agua Peptonada amortiguada.
A.4.2. RVS.
A.4.3. MKTTn.
A.4.4. XLD.
A.4.5. EH.
A.4.6. ASB.
A.4.7. Agar Verde Brillante.
A.4.8. Agar nutritivo.
A.4.9. TSI.
A.4.10. LIA.
A.4.11. Agar Urea de Christensen.
A.4.12. Medio L-Lisina descarboxisolato.
A.4.13. Solución salina fisiológica.
A.4.14. Medio Triptófano/Triptona.
A.5. REACTIVOS.
A.5.1. Reactivos para la reacción VP.
A.5.2. Reactivos para la reacción de indol.
A.5.3. Antisuero somático (O) polivalente de Salmonella.
A.5.4. Tolueno.
A.5.5. a-naftol.
A.5.6. Solución de creatina.
A.5.7. KOH.
A.5.8. Salmonella Typhimurium (S. Typhimurium).
A.5.9. Salmonella diarizonae ATCC 12325. (S. diarizonae)
A.5.10. Salmonella abortus equi ATCC 9842. (S. abortus equi)
A.5.11. ONPG.
A.5.12. Novobiocina (sal sódica).
A.5.13. Yodo.
A.5.14. Yoduro de Potasio.
A.5.15. Alcohol etílico 96%4-Dimetilaminobenzaldehído.
A.5.16. Ácido hidroclórico, r = 1.18g/mL a 1.19g/mL.
A.5.17. 2-metilbutan-2-ol.
A.5.18. Cloruro de sodio.
A.5.19. Monohidrato de creatinina.
A.6. CONDICIONES DE PRUEBA.
A.6.1. Muestreo.
Es importante que el laboratorio se cerciore de recibir una muestra representativa y que no haya tenido daños o cambios durante el transporte y/o almacenamiento.
El muestreo no es parte del método especificado aquí, es recomendable que las partes involucradas en este punto lleguen a un acuerdo al respecto, pueden utilizarse diversos estándares internacionales tales como los planes de muestreo del CODEX alimentarios o las guías del ICMSF.
A.6.2. Preparación de la muestra de ensayo.
Lineamientos generales para la preparación de las muestras.
A.6.2.1. General. Bibliografía 10.23
La preparación de la suspensión inicial requiere 25g de la muestra en una cantidad suficiente del medio de pre-enriquecimiento, para obtener una dilución 1:10.
En una situación atípica y justificada, si la porción de muestra utilizada en el ensayo es distinta a 25g, se deberá utilizar la cantidad necesaria de medio de pre-enriquecimiento para obtener una dilución 1:10.
En casos excepcionales, cuando es necesario analizar más de una porción de 25g de un lote específico de alimento y teniendo evidencia de que si hay mezcla de tales porciones no afecta el resultado, las muestras pueden ser compuestas; es decir, si 10 muestras de 25g serán examinadas, combinar las 10 porciones para obtener 250g y adicionar 2,25L del caldo de pre-enriquecimiento precalentado a 37 °C +/-1 °C.
Sin embargo, se debe tomar en cuenta que para inocular el caldo selectivo RVS y MKTTn aumentarán las porciones de 10mL a 100mL teniendo que inocular 1mL y 10mL respectivamente. Continuar como se indica en A.7.
A.6.2.2. Productos que contienen cacao. Bibliografía 10.23
Agregar al agua peptonada amortiguada 50g/L de caseína (no usar caseína ácida) o 100g/L de leche descremada en polvo, si el alimento tiene alta probabilidad de estar contaminado con microorganismos Gram positivos, incubar a 37 °C ± 1 °C por 2h, añadir 0.018g/L de verde brillante. Continuar como se indica en A.7.
A.6.2.3. Productos ácidos y acidificantes. Bibliografía 10.23
Asegurarse de que el pH no se encuentre por debajo de 4.5 durante el preâenriquecimiento, puede utilizarse agua peptonada amortiguada a doble concentración. En caso de que se requiera subir el pH a más de 4.5 utilizando NaOH 1N, registrar esta cantidad. Continuar como se indica en A.7.
A.6.2.4. Preparación de la muestra para moluscos en concha. Bibliografía 10.24
En general, deben tomarse un mínimo de 10 a 12 moluscos bivalvos, a fin de obtener una muestra representativa y permitir la selección de animales completos disponibles para su desconche. Con la mayoría de las especies, esto permite una adecuada selección y se obtendrán aproximadamente 200g de licor y carne. Por otro lado 10 a 12 piezas de ciertas especies pequeñas de moluscos bivalvos, pueden producir mucho menos que 100g de licor y carne por lo que se deben usar de 20 a 30 piezas de estas especies para obtener el peso adecuado.
Limpieza de la concha. Lavarse las manos con agua potable y jabón antes de comenzar. Enjuagar el exceso de suciedad de las conchas y cepillar con un cepillo estéril bajo el chorro de agua potable poniendo particular atención en las hendiduras de las conchas. Colocar las conchas limpias en toallas de papel absorbente o gasas limpias. Desechar los moluscos que tengan las conchas dañadas o con las valvas abiertas.
Remoción del contenido. Lavarse las manos con agua, jabón y enjuagarse con alcohol al 70%. Se puede utilizar guantes para evitar lesionarse. Sostener el molusco en la mano sobre una gasa dirigiendo la unión de las valvas o bisagra hacia el analista apoyándose sobre la mesa. Con un cuchillo desconchador estéril, insertar la punta entre las valvas y hacer palanca para cortar el músculo abductor. Drenar el licor de la concha dentro de un recipiente estéril. Cortar el músculo abductor de las conchas y vaciar el cuerpo del animal dentro del mismo recipiente. Continuar como A.6.2.5
A.6.2.5. Procedimiento para moluscos, desconchados y congelados. Bibliografía 10.24
Pesar el total de la muestra, máximo 200g (carne y licor) y adicionar igual cantidad de agua peptonada amortiguada para obtener una dilución 1:2. Licuar por 2 min. Continuar como se indica en A.7.
A.6.2.6. Yema de huevo en polvo, clara de huevo en polvo, huevo en polvo, leche fluida, leche descremada, leche con 2% de grasa, entera y suero de leche. Mezclas preparadas en polvo (Harinas para pastel, galletas, donas, bisquets y pan) Fórmulas infantiles y alimentos para administración por cánula u oral, que contengan huevo. De preferencia, no descongelar las muestras antes de su análisis. Si están congeladas, atemperar las muestras para obtener la porción analítica. Descongelar tan rápido como sea posible para disminuir el incremento en el número de microorganismos competentes o para reducir el daño potencial sobre las células de Salmonella. Descongelar en un baño de agua con temperatura controlada a 45 °C, durante 15 min y con agitación constante, o descongelar manteniendo la muestra a 2-5 ºC durante 18h. Pesar 25g de la muestra en condiciones asépticas, colocar en un frasco de boca ancha y tapa de rosca de 500mL. Si las muestras no están en polvo, agregar 225mL de agua peptonada amortiguada. Si el producto es un polvo, agregar aproximadamente 15mL de agua peptonada y agitar con una varilla de vidrio, cuchara o
abate lenguas. hasta obtener una suspensión homogénea. Agregar tres porciones más de 10, 10, y 190mL para un total de 225mL. Agitar suficientemente hasta que la suspensión no contenga grumos. Tapar el frasco y dejar en reposo durante 60 ± 5 min a temperatura del laboratorio. Mezclar por agitación Aflojar la tapa a un 1/4 de vuelta, e incubar a 37 °C 18 ± 2h. Continuar como se indica en A.7.
A.6.2.7. Huevos.
A.6.2.7.1. Huevo en cascarón. Eliminar cualquier material ajeno adherido a la superficie del cascarón. Desinfección del cascarón: Preparar la solución desinfectante (1:3) que consiste en adicionar 3 partes de una solución de etanol o isopropanol al 70% a una parte de solución de yodo/yoduro de potasio. Preparar una solución de alcohol al 70% diluyendo 700mL de etanol al 100% hasta completar un volumen final de 1000mL de agua destilada estéril o bien diluir 700mL de alcohol al 95% con agua destilada estéril hasta completar un volumen final de 950mL. La solución de yodo/yoduro de potasio se prepara como sigue: Pesar 100g de yoduro de potasio y disolver en 200-300mL de agua destilada estéril. Adicionar 50g de yodo y calentar suavemente con agitación constante hasta disolver el yodo. Disolver esta solución hasta completar un volumen final de 1000mL de agua destilada estéril y almacenar en una botella ámbar con tapón de vidrio en la oscuridad. Sumergir los huevos en esta solución por al menos 10 seg, sacarlos y dejar secar al aire. Cada muestra consiste de 20 huevos, en un total de 50 muestras por cada gallinero. Abrir los huevos en condiciones asépticas con guantes estériles y pasar a un recipiente estéril, cambiar guantes entre cada muestra. Evitar que fragmentos del casarón caigan en el contenedor. Mezclar completamente las yemas y claras con una cuchara o cualquier otro instrumento estéril. Mantener las muestras a temperatura ambiente (20-24 °C) por 96 ± 2h. Después de este tiempo, tomar 25mL o 25g de la mezcla anterior y 25mL de un CST de prueba (testigo) en un contenedor de 500mL y agregar 225mL de CST suplementado con sulfato ferroso. (35mg de sulfato ferroso a 1000mL de CST. Mezclar bien por agitación. Dejar en reposo durante 60 ± 5min a temperatura ambiente. Mezclar nuevamente por agitación y determinar pH con papel indicador. Ajustar el pH, si es necesario, a 6.8 ± 0.2. Incubar 24 ± 2h a 35 °C. Continuar como se indica en A.7.
A.6.2.7.2. Huevo entero líquido (homogeneizado). Combinar 15 porciones de 25mL cada una para dar una muestra combinada de 375mL en un matraz Erlenmeyer de 6L. Mantener esta mezcla a temperatura ambiente (20-25 °C) por 96 ± 2h. Después de este tiempo, adicionar 3375mL de CST suplementado con sulfato ferroso. Mezclar bien por agitación. Dejar en reposo durante 60 ± 5 min a temperatura ambiente. Mezclar nuevamente por agitación y determinar pH con papel indicador. Ajustar el pH, si es necesario, a 6.8 ± 0.2. Incubar 24 ± 2h a 35 °C. Continuar como se indica en A.7.
A.6.2.7.3. Huevo cocido (de pollo, pato u otros, hervidos). Si el cascarón del huevo se encuentra intacto, desinfectar como se describe en el inciso 9.1.2 a) y separar en condiciones asépticas el cascarón. Pulverizar la yema y la clara y pesar 25g en un matraz Erlenmeyer de 500mL u otro recipiente apropiado. Agregar 225mL CST (sin sulfato ferroso). Mezclar bien por agitación y continuar como se describe en para huevo en cascaron.
A.6.2.8. Leche descremada en polvo y Caseína. Adicionar el agua peptonada amortiguada preferiblemente 50g/l de caseína (a excepción de caseína acida) o 100g/L de leche descremada en polvo y adicionar después de 2h de incubación, 0.018g/L de verde brillante si el alimento tiene alta probabilidad de estar contaminado con microbiota Gram Positivo. Incubar a 37 °C ±2h. Continuar como se indica en A.7.
A.6.2.9. Productos que contienen huevo (pastas, rollos de huevo, macarrones, espagueti), quesos, ensaladas preparadas a base de: jamón, huevo, pollo, atún, pavo; frutas y verduras frescas congeladas o secas; frutas secas, carne, crustáceos (camarones, cangrejo, cangrejo de río, langosta, langostinos) y pescado. De preferencia, no descongelar muestras congeladas, antes de someterlas al análisis. Si está congelada, para obtener la porción por analizar debe dejarse atemperar, descongelando cerca de 45 °C durante <15 min, en un baño de agua con temperatura controlada y flujo continuo o preferentemente mantener durante 18h a 2-5 °C. Pesar en condiciones asépticas, 25g de muestra en un vaso de licuadora. Agregar 225mL de agua peptonada amortiguada y licuar por 2 min. Pasar a un frasco estéril de boca ancha y tapa de rosca de 500mL. Mezclar por agitación, aflojar la tapa a 1/4 de vuelta e incubar durante 18 ± 2h a 37 °C. Continuar como se indica en A.7.
A.6.2.10. Levadura seca (levadura activa e inactiva). Pesar en condiciones asépticas, 25g de muestra, en un frasco estéril de boca ancha y tapa de rosca de 500mL. Agregar 225mL de CST. Mezclar bien hasta formar una suspensión homogénea. Dejar en reposo, a la temperatura del laboratorio, durante 60 ± 5 min, con la tapa bien cerrada. Mezclar bien por agitación y determinar pH con papel indicador. Ajustar el pH si es necesario, a 6.8 ± 0.2. Mezclar bien antes de ajustar el pH final. Aflojar la tapa a 1/4 de vuelta e incubar durante 24 ± 2h a 35 °C. Continuar como se indica en A.7.
A.6.2.11. Mezclas para repostería o cremas pasteleras. Pesar en condiciones asépticas, 25g de
muestra, en un frasco estéril de boca ancha y tapa de rosca, de 500mL. Agregar 225mL de caldo nutritivo y mezclar bien. Dejar en reposo a la temperatura del laboratorio, durante 60 ± 5 min, con la tapa bien cerrada. Ajustar el pH si es necesario, a 6.8 ± 0.2 mezclar bien, antes de ajustar el pH final. Aflojar la tapa a 1/4 de vuelta e incubar durante 24 ± 2h a 35 °C. Continuar como se indica en A.7.
A.6.2.12. Especias.
A.6.2.12.1. Pimienta negra, pimienta blanca, semillas de apio en hojuelas, chile en polvo, cominos, páprika, hojuelas de perejil, romero, semilla de ajonjolí, tomillo y yerbas en hojuelas. Pesar en condiciones asépticas, 25g de muestra, en un frasco estéril de boca ancha y tapa de rosca de 500mL. Agregar 225mL de CST. Mezclar bien. Dejar en reposo con la tapa bien cerrada, durante 60 ± 5min a temperatura de laboratorio. Mezclar bien por agitación y determinar pH con papel indicador. Ajustar el pH si es necesario, a 6.8 ± 0.2. Mezclar bien, antes de ajustar el pH final. Aflojar la tapa a 1/4 de vuelta e incubar durante 24 ± 2h a 35 °C. Continuar como se indica en A.7.
A.6.2.12.2. Cebolla en hojuelas, cebolla en polvo, ajo en hojuelas. Pesar en condiciones asépticas, 25g de muestra, en un frasco estéril de boca ancha y tapa de rosca, de 500mL. Pre-enriquecer la muestra en CST adicionado con K2SO3 (5 g K2SO3 por 1000mL de CST, resultando una concentración final de 0.5% de K2SO3). Agregar el K2SO3 al caldo antes de esterilizar, distribuir en volúmenes de 225mL en matraces Erlemeyer de 500mL esterilizar a 121 °C por 15 min. Después de esterilizar, determinar el pH asépticamente, si es necesario, ajustar el volumen final a 225mL. Agregar 225mL de CST adicionado con K2SO3, a los 25g de muestra y mezclar bien. Continuar como se indica en el punto anterior.
A.6.2.12.3. Pimienta de jamaica, canela, clavo y orégano. Hasta ahora, no se conocen métodos para neutralizar la toxicidad de estas cuatro especias. Lo que se recomienda para su análisis, es diluirlas más allá de su nivel tóxico. En el caso de la pimienta de jamaica, canela y orégano; preparar diluciones con una relación 1:100 muestra/caldo; y para el clavo, una relación 1:1000. En el caso de condimentos en hojas secas, preparar diluciones cuya relación sea mayor a 1:10, debido a las dificultades que se han encontrado para que el caldo se absorba en productos deshidratados. Analizar estas especias como se describe en para la pimienta negra, manteniendo las relaciones muestra/caldo, recomendadas.
A.6.2.13. Dulce, cubierta de dulce (incluyendo chocolate). Pesar en condiciones asépticas, 25g de muestra en un vaso de licuadora. Agregar 225mL de leche descremada, reconstituida, estéril y licuar por 2 min. Pasar la mezcla homogeneizada a un frasco de boca ancha, con tapón de rosca de 500mL y dejar en reposo durante 60 ± 5 min, con la tapa bien cerrada, a temperatura del laboratorio. Mezclar bien por agitación y determinar pH con papel indicador. Ajustar el pH si es necesario a 6.8 ± 0.2. Agregar 0.45mL de solución acuosa de verde brillante al 1% y mezclar bien. Aflojar la tapa a 1/4 de vuelta e incubar durante 24 ± 2h a 35 °C. Continuar como se indica en A.7.
A.6.2.14. Coco. Pesar, en condiciones asépticas, 25g de muestra, en un frasco estéril de boca ancha y tapa de rosca, de 500mL o cualquier otro recipiente adecuado. Agregar 225mL de caldo lactosado estéril. Agitar bien y dejar en reposo a la temperatura del laboratorio durante 60 ± 5 min, con la tapa bien cerrada. Mezclar bien por agitación y determinar pH con papel indicador. Ajustar el pH si es necesario, a 6.8 ± 0.2. Agregar hasta 2.25mL de Tergitol /Aniónico (pasado por vapor fluente durante 15 min) y mezclar bien. Alternativamente se puede usar Triton X-100 (pasado por vapor fluente durante 15 min). Limitar el uso de estos surfactantes a la cantidad mínima necesaria para iniciar la espuma. En el caso de Triton X-100, con 2 a 3 gotas es suficiente. Aflojar la tapa a un a l/4 de vuelta e incubar durante 24 ± 2h a 35 °C. Continuar como se indica A.7.
A.6.2.15. Colorantes y substancias coloridas para alimentos. En el caso de colorantes con pH mayor a 6.0 (suspensiones acuosas al 10%), aplicar el método descrito para huevo entero desecado.
A.6.2.16. Colorante (lacas) o colorantes con pH abajo 6.0, pesar en condiciones asépticas, 25 g de muestra en un frasco estéril de boca ancha y tapa de rosca de 500mL o cualquier otro recipiente adecuado. Agregar 225mL de caldo tetrationato (CTT) sin verde brillante. Mezclar bien por agitación y determinar pH con papel indicador. Ajustar el pH. Agitar bien y dejar en reposo a la temperatura del laboratorio durante 60 ± 5 min, con la tapa bien cerrada. Ajustar el pH a 6.8 ± 0.2 con un potenciómetro y agregar 2.25mL de solución al 0.1% de verde brillante mezclar completamente, por agitación. Aflojar la tapa a un l/4 de vuelta e incubar durante 24 ± 2h a 35 °C. Continuar como se indica en A.7.3
A.6.2.17. Gelatina. Pesar, en condiciones asépticas, 25g de muestra, en un frasco estéril de boca ancha y tapa de rosca, de 500mL o cualquier otro recipiente adecuado. Agregar 225mL de agua peptonada amortiguada estéril, agregar 5mL de solución acuosa de papaína al 5% y mezclar bien. Colocar la tapa bien cerrada e incubar a 37 °C por 60 ± 5 min. Mezclar bien y aflojar la tapa a un 1/4 de vuelta e incubar durante 18 ± 2h a 35 °C. Continuar como se indica en A.7.
A.6.2.18. Carnes, substitutos de carne, productos cárnicos, sustancias de origen animal, glándulas y otros alimentos (pescado, carne y hueso). Pesar, en condiciones asépticas, 25g de muestra, en un vaso de licuadora. Agregar 225mL de agua peptonada amortiguada estéril y licuar por 2 min. Aflojar la tapa a un l/4 de vuelta e incubar durante 24 ± 2h a 37 °C. Continuar como se indica en A.7.
A.6.2.19. Ancas de rana. Colocar 15 pares de ancas de rana en una bolsa de plástico estéril y cubrirlas con agua peptonada amortiguada en una proporción 1:9 muestra/caldo (g/mL). Si se estima que un solo par de ancas, pesa un promedio de 25g o más, analizar un solo par, por cada 15 pares. Colocar la bolsa en un vaso de plástico grande o cualquier otro recipiente. Incubar a 37 °C por 18 ± 2h. Continuar el análisis, como se indica en A.7.
A.6.2.20. Conejo en canal. Introducir el conejo en una bolsa de plástico estéril y colocarlo en un vaso u otro contenedor adecuado. Adicionar agua peptonada amortiguada en una proporción 1:9 De muestra/caldo (g/mL) para cubrir la muestra. Mezclar bien con agitación Incubar a 37 °C por 18 ± 2h. Continuar el análisis como se indica en A.7.
A.6.2.21. Jugo de naranja (pasteurizado y sin pasteurizar), jugo de manzana (pasteurizado y sin pasteurizar), En condiciones asépticas, agregar 25mL de la muestra y 225mL de agua peptonada amortiguada, en un frasco de boca ancha estéril, con tapa de rosca de 500mL u otro recipiente apropiado. Agitar para mezclar completamente. Incubar con la tapa suelta por 18 ± 2h a 35 °C. Continuar como se indica en A.9. (alimento de carga microbiana baja).
A.6.2.22. Orejas de puerco. Colocar en un bolsa de plástico una pieza (de 2 a 3 piezas si éstas son pequeñas) por cada unidad analítica. Introducir la bolsa en un vaso o en un contenedor adecuado. Adicionar agua peptonada amortiguada en una proporción 1:9 de muestra/caldo (g/mL) para cubrir las piezas. Mezclar bien con agitación e incubar a 37 °C por 18 ± 2h. Continuar como se indica en 9.2.
A.6.2.23. Melones. Preferentemente no descongelar las muestras antes del análisis. Si la muestra está congelada atemperar las muestras para obtener la porción analítica. Descongelar en un baño de agua con temperatura controlada con termostato, a 45 °C durante 15 min y con agitación constante, o descongelar manteniendo la muestra a 2-5 ºC durante 18h. Para la fruta picada o cortada, pesar 25g en condiciones asépticas en un vaso de licuadora. Adicionar 225mL de agua peptonada amortiguada estéril y licuar por 2 min. Pasar el homogeneizado a un frasco estéril de boca ancha y tapa de rosca, de 500mL o cualquier otro recipiente adecuado. Aflojar la tapa e incubar a 37 °C por 18 ± 2h. Continuar como se indica en A.7.
A.6.2.24. Para melones enteros no enjuagarlos aun si presentan tierra o suciedad visible. Analizarlos como estén. Colocar los melones en una bolsa de plástico estéril. Agregar suficiente agua peptonada amortiguada que permita que el melón flote. El volumen del agua peptonada amortiguada puede ser una y media veces el peso del melón. Por ejemplo los melones pesan 1500g probablemente se necesitará un volumen de aproximadamente 2250mL de agua peptonada amortiguada. Adicionar más agua peptonada amortiguada si es necesario. Colocar la bolsa de plástico con los melones y el agua en un vaso u otro contenedor adecuado. Doblar el extremo de la bolsa de plástico de forma segura pero no apretada para que permita el paso de aire durante la incubación. Incubar abriendo ligeramente la bolsa a 37 °C por 18 ± 2 h. Continuar como A.7.
A.6.2.25. Mangos. De preferencia, no descongelar las muestras antes de su análisis. Si están congeladas, atemperar las muestras para obtener la porción analítica. Descongelar en un baño de agua con temperatura controlada y termostato, a 45 °C durante 15 min y con agitación constante, o descongelar manteniendo la muestra a 2-5 ºC durante 18h. Para la fruta picada o cortada, pesar 25g en condiciones asépticas en un vaso de licuadora. Adicionar 225mL de agua peptonada amortiguada estéril y licuar por 2 min. En condiciones asépticas, pasar el homogeneizado a un frasco estéril de boca ancha y tapa de rosca, de 500mL o cualquier otro recipiente adecuado. Aflojar la tapa 1/4 de vuelta e incubar a 37 °C por 18 ± 2h. Continuar como se indica en A.7.
A.6.2.26. Para mangos enteros no enjuagarlos aun si presentan tierra o suciedad visible. Analizarlos como estén. Colocar el mango en una bolsa de plástico estéril. Agregar suficiente agua peptonada amortiguada que permita que el mango flote. El volumen del agua peptonada amortiguada puede ser una vez el peso los mangos. Por ejemplo los mangos pesan 500g, probablemente se necesitará un volumen de aproximadamente 500mL de agua peptonada amortiguada para que floten. Adicionar más agua peptonada amortiguada si es necesario. Colocar la bolsa de plástico con los mangos y el agua peptonada amortiguada en un vaso u otro contenedor de 5 L. Incubar abriendo ligeramente la bolsa a 37 °C por 18 ± 2 h. Continuar como A.7.
A.6.2.27. Tomates (tomates rojos o jitomates). Para la fruta picada o cortada, pesar 25g en condiciones asépticas en un vaso de licuadora. Adicionar 225mL de agua peptonada amortiguada estéril y licuar por 2 min. En condiciones asépticas, pasar el homogeneizado a un frasco estéril de boca ancha y tapa de rosca, de 500mL o cualquier otro recipiente adecuado. Aflojar la tapa a l/4 de vuelta e incubar durante 18 ± 2h a 37 °C. Continuar como se indica en A.7.
A.6.2.28. Para tomates enteros no enjuagarlos aun si presentan tierra o suciedad visible. Analizarlos como estén. Colocar los tomates en una bolsa de plástico estéril. Agregar suficiente agua peptonada amortiguada que permita que los tomates floten. El volumen del caldo universal puede ser una vez el peso de los tomates. Por ejemplo los tomates pesan 300g probablemente se necesitará un volumen de aproximadamente 300mL de agua peptonada amortiguada. Adicionar más agua pepetonada amortiguada si es necesario. Colocar la bolsa de plástico con los tomates y el caldo en un vaso u otro contenedor adecuado. Doblar el extremo de la bolsa de plástico de forma segura pero no apretada para que permita el paso de aire durante la incubación. Incubar abriendo ligeramente la bolsa a 37 °C por 18 ± 2h. Continuar como A.7.
A.6.2.29. Muestras ambientales. Muestrear superficies ambientales con hisopos o esponjas estériles. Colocarlos en una bolsa estéril que contenga suficiente caldo Dey-Engly o solución de fosfatos para cubrir los hisopos o esponja. Transportar las muestras protegidas en un contenedor con paquetes de gel congelado para mantener las muestras frías, pero no congeladas. Si las muestras no pueden ser procesadas inmediatamente, refrigerarlas a 4 ± 2 °C. Analizar las muestras dentro de las siguientes 48 ± 2h después de haber sido muestreadas, agregar a la bolsa o contenedor que contiene los hisopos o esponjas 225mL de agua peptonada amortiguada estéril. Agitar bien el contenido. Mezclar, por agitación, aflojar la tapa o la boca de la bolsa e incubar durante 18 ± 2h a 37 °C. Continuar como se indica en A.7.
A.6.2.30. Semillas de alfalfa y frijoles. En condiciones asépticas pesar 25g de semillas de alfalfa y frijoles en un matraz Erlenmeyer. Adicionar 225mL de agua peptonada amortiguada agitar el matraz. Cubrir la boca del matraz con papel aluminio estéril. Incubar a 37 °C durante 18 ± 2h. Continuar como se indica en A.7.2 (tratarla como un alimento con carga microbiana alta).
A.6.2.31. Agua para consumo humano. Debido a que el agua para consumo humano pasa por procesos de potabilización y purificación, los niveles de microorganismos viables son bajos, por lo que es necesario utilizar métodos de concentración.
A.6.2.31.1. Filtración por membrana. Este método es recomendable para aguas con baja turbiedad. Filtrar 1L o más de la muestra de agua. Retirar la membrana y colocarla en 50mL de agua pepetonada amortiguada Incubar a 37 °C por 18 ± 2h. Continuar como se describe en A.7.
Nota: Para porciones grandes de agua peptonada amortiguada precalentar a 37 °C ± 1 °C antes de la inoculación de la muestra a analizar.
A.7. PROCEDIMIENTO ANALÍTICO.
A.7.1. Pre-enriquecimiento.
En general incubar la dilución inicial a 37 °C ± 1 °C por 18h ± 2h.
Para moluscos en concha, desconchados y congelados, inocular a temperatura ambiente 50g del homogenizado (dilución 1:2) a 200mL de agua peptonada amortiguada e incubar a 37 °C ± 1 °C por 18h ± 2h.
A.7.2. Enriquecimiento selectivo.
Transferir 0.1mL del cultivo de pre-enriquecimiento a un tubo del 10mL de caldo RVS y 1mL a un tubo conteniendo 10mL de caldo MKTTn.
Incubar el caldo RVS a 41.5 °C ± 1 °C por 24h ± 3h y el caldo MKTTn a 37 °C ±1 °C por 24h ± 3h.
A.7.3. Aislamiento e identificación.
Para el aislamiento, inocular a partir de los cultivos obtenidos en el punto anterior, tres medios selectivos en placa como sigue:
Agar XLD y cualquier otro medio selectivo sólido complementario al agar XLD y especialmente apropiado para el aislamiento de Salmonella lactosa positiva, Salmonella Typhi y Salmonella Paratyphi; el laboratorio puede seleccionar que medio utilizar. Por ejemplo, se pueden elegir el ASB, EH, Agar Verde Brillante, entre otros.
El agar XLD se incuba a 37 °C ± 1 °C durante 24h ± 3h, el segundo y tercero agar selectivo incubar de acuerdo a las recomendaciones contenidas en los manuales de medios de cultivo de los fabricantes.
A.7.3.1. Morfología Colonial Típica de Salmonella.
Seleccionar 2 o más colonias de Salmonella de acuerdo con las características siguientes, en cada agar selectivo:
A.7.3.1.1. XLD. Colonias rosas con o sin centro negro. Muchos cultivos de Salmonella pueden producir colonias con un centro negro muy grande o completamente negras.
A.7.3.1.2. EH. Colonias azul-verde o azules, con o sin centro negro. Muchos cultivos de Salmonella pueden producir colonias con un centro negro muy grande o completamente negras.
A.7.3.1.3. ASB. Colonias cafés, grises o negras; algunas veces pueden presentar brillo metálico y el medio circundante a la colonia generalmente es café al principio y a medida que se prolonga el tiempo de incubación, pueden aparecer de color negro.
Si se presentan colonias típicas en ASB después de 24 ± 2h de incubación, seleccionar 2 o más colonias. Si por el contrario, no se observan colonias típicas a las 24 ± 2h, re-incubar las placas de ASB, otras 24 ± 2h. Después de 48 ± 2h de incubación, seleccionar si están presentes, 2 o más colonias típicas. Si las colonias seleccionadas, no dan reacciones típicas en TSI y LIA, el cultivo se considera como negativo a Salmonella.
A.7.3.2. Morfología Colonial Atípica de Salmonella.
En ausencia de colonias típicas sospechosas de Salmonella, buscar colonias atípicas con las características siguientes:
A.7.3.2.1. Agares EH y XLD. Muy pocos cultivos atípicos de Salmonella producen colonias amarillas con o sin centro negro. En ausencia de colonias típicas, en EH y XLD, seleccionar 2 o más colonias atípicas.
Nota: Algunas cepas variables de Salmonella como: H2S negativo (ej. S. Paratyphi A) crece en XLD como colonias rosas con el centro de un color rosa obscuro. Salmonella Lactosa â positiva crece en XLD como colonias amarillas con o sin el centro negro.
A.7.3.2.2. ASB. Algunos cultivos producen colonias verdes con un halo oscuro muy pequeño. Si después de 48h de incubación (como se explicó anteriormente), no hay colonias típicas sospechosas en ASB, seleccionar 2 o más colonias atípicas.
A.7.3.3. Cultivos Control Sugeridos.
Además de los cultivos control positivos (Salmonella Typhimurium ATCC14028), deben usarse controles adicionales para ayudar a la selección de colonias atípicas, se recomiendan: S. diarizonae (ATCC 12325) lactosa positivo, H2S positivo y S. abortus equi (ATCC 9842), lactosa-negativo, H2S-negativo; o S. diarizonae (ATCC 29934) lactosa-positivo, H2S-negativo.
A.7.3.4. Selección de colonias para su confirmación.
Para la confirmación, tomar de cada medio selectivo al menos dos colonias consideradas como típicas o 4 colonias sospechosas si no existe la primera posibilidad.
En casos epidemiológicos identificar al menos 5 colonias típicas y 5 atípicas, si en una placa se encuentran menos de 5 colonias típicas o sospechosas, confirmar todas las colonias que se encuentren en el medio.
Estriar cada colonia seleccionada en agar nutritivo, preferiblemente sin agua de condensación, de tal manera que permita el aislamiento de colonias. Incubar las placas inoculadas a 37 °C ± 1 °C durante 24h ± 3h.
Utilizar cultivos puros para la confirmación por pruebas bioquímicas y serología.
A.7.3.5. Confirmación Bioquímica.
A partir del agar nutritivo, con un asa recta, estéril tocar ligeramente el centro de la colonia seleccionada e inocular en tubos de agar inclinado de TSI y LIA. Sembrar por picadura en el fondo y estría en la superficie inclinada. Debido a que la reacción de descarboxilación de la lisina, es estrictamente anaerobia, el fondo del medio de LIA, debe medir 4cm. Mantener las placas de agares selectivos a 5-8 ºC.
Incubar los tubos de TSI y LIA a 37 °C ± 1 °C por 24 ± 3h. Dejar los tapones flojos de los tubos para mantener condiciones de aerobiosis mientras se incuban evitando excesiva producción de H2S. Interpretar los cambios de color como se describe a continuación:
TSI: Fondo del medio;
- Amarillo, glucosa positiva.
- Rojo o sin cambio de color, glucosa negativa.
- Negro, formación de sulfuro de hidrógeno.
- Burbujas o grietas en el medio, formación de gas debido a la utilización de la glucosa.
TSI: Superficie inclinada.
- Amarillo, lactosa y/o sacarosa positivos.
- Rojo o sin cambio de color, lactosa y/o sacarosa negativa.
Las colonias típicas de Salmonella, producen alcalinidad (color rojo) en la parte inclinada del medio y ácido (color amarillo) en el fondo; con producción de gas y cerca del 90% de las casos producen H2S (ennegrecimiento del agar). Cuando alguna Salmonella lactosa positiva es aislada, el agar de TSI se torna completamente amarillo.
En LIA, Salmonella produce reacción alcalina (color púrpura) Considerar como negativos los cultivos que produzcan claramente un color amarillo en el fondo del tubo. La mayoría de los cultivos de Salmonella producen H2S en LIA. Algunos cultivos que no son de Salmonella, producen un color rojo ladrillo en la parte inclinada del LIA.
Todos los cultivos que den reacción alcalina en el fondo del medio de LIA, independientemente de la reacción que hayan dado en TSI, deben retenerse como aislamientos presuntivos de Salmonella, para someterlos a pruebas bioquímicas adicionales y pruebas serológicas.
Para los cultivos de TSI que se consideran presuntivos para Salmonella, continuar como se indica en Identificación de Salmonella para determinar la especie, incluyendo Salmonella arizonae.
a) Prueba de ureasa (convencional). Con un asa estéril inocular tubos de agar urea de Christensen. Debido a que algunas veces los tubos de agar urea de Christensen sin inocular, pueden virar a rojo púrpura (prueba positiva), debe incluirse, un tubo de este agar sin inocular como control. Una prueba positiva está dada por el uso de la urea generando amoniaco produciendo un cambio en la coloración del medio a color rojo rosado, una prueba negativa no se produce cambio en la coloración (amarillo anaranjado). Incubar 24 ± 2h a 37 °C ± 1 °C.
b) Caldo L-lisina descarboxilasa.
Si la prueba de LIA fue satisfactoria, no es necesario repetirla. Si la reacción de LIA fue dudosa, utilizar caldo lisina descarboxilasa para la determinación final de lisina descarboxilasa. Inocular el caldo con pequeña cantidad de cultivo. Cerrar la tapa fuertemente e incubar durante a 37 °C ± 1 °C por 24 ± 3h. Las especies de Salmonella dan reacción alcalina (color púrpura del medio). La prueba negativa se interpreta por un color amarillo del medio. Si el medio aparece descolorido (ni púrpura, ni amarillo), agregar unas gotas de colorante púrpura de bromocresol al 0.2% y leer nuevamente la reacción.
c) Detección de b-galactosidasa.
Colocar la colonia seleccionada en un tubo conteniendo 0.25mL de solución salina, agitar para obtener una suspensión homogénea. Adicionar 1 gota de tolueno y agitar. Colocar el tubo en un baño de agua a 37 °C ± 1 °C dejar reposar por aproximadamente 5 min. Adicionar 0.25mL del agente de detección de la b-galactosidasa y mezclar. Colocar nuevamente el tubo en el baño de agua a 37 °C ± 1 °C y dejar por 24h ± 3h. Examinar el tubo a intervalos de tiempo. Un color amarillo es indicativo de reacción positiva, la cual se hace evidente en aproximadamente 20 min.
Si se utilizan discos comerciales, seguir las instrucciones del fabricante.
d) Prueba de Indol.
Inocular un tubo conteniendo 5mL del medio triptófano/triptona con una suspensión homogénea de la colonia sospechosa.
Incubar a 37 °C ± 1 °C por 24 ± 3h después de la incubación adicionar 1mL de reactivo de Kovacs.
La formación de un anillo de color rojo indica una reacción positiva. Un anillo de color amarillo indica una reacción negativa.
e) Prueba de VP.
Re-suspender una asada de la colonia seleccionada en un tubo estéril conteniendo 3mL del medio VP. Incubar 37 °C ± 1 °C por 24 ± 3h.
Después de la incubación adicionar 2 gotas de solución de creatinina, 3 gotas de solución 1-naftol y al final 2 gotas de solución de KOH, agitar después de cada reactivo.
La formación de un color rosa a rojo brillante en menos de 15 min indica una reacción positiva.
f) Identificación presuntiva del género Salmonella.
Alternativamente se pueden utilizar pruebas bioquímicas miniaturizadas o métodos de biología molecular disponibles en el mercado para la identificación presuntiva de género Salmonella, se deberá utilizar un sistema adecuado basado en el sistema bioquímico descrito en esta sección. Estos sistemas bioquímicos deberán contar con validación y no deben ser usados como sustitutos de las pruebas serológicas. Inocular e incubar estos sistemas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
A.7.3.5.1. Interpretación de las pruebas bioquímicas.
Tabla A.1. Interpretación de pruebas bioquímicas.
S. diarizonae (ATCC 12325) lactosa positivos, H2S positivo y S. abortus equi (ATCC 9842), lactosa-negativo, H2S-negativo; o S. diarizonae (ATCC 29934) lactosa-positivo, H2S-negativo.
A.7.3.5.2. Pruebas Serológicas.
A.7.3.5.3. General.
La aglutinación con el antisuero polivalente Poly A-I & Vi, puede usarse como resultado confirmatorio de la presencia de Salmonella para las cepas probadas por TSI y LIA, existen cepas que no aglutinan con el polivalente, para éstos es necesario confirma usando la batería completa de bioquímicas.
A.7.3.5.4. Eliminación de las cepas autoaglutinables.
Deposite una gota de solución salina, en una lámina de vidrio perfectamente limpia. Disperse con un asa, parte de la colonia a probar en la gota, de manera que se obtenga una suspensión homogénea y turbia. Rote suavemente la lámina por 30 a 60seg. Observe el resultado sobre un fondo oscuro, preferiblemente con la ayuda de una lupa. Si las bacterias se agrupan en unidades más o menos distintas, la cepa se considera
como autoaglutinable y no debe someterse a las siguientes pruebas, porque la detección de los antígenos no es factible.
NOTA: También es posible dispersar parte de la colonia a analizar en una gota de agua, y luego mezclar esta solución con una gota de la solución salina.
A.7.3.5.5. Detección de los antígenos Poly A-I & Vi.
Empleando una colonia pura no autoaglutinable, proceda, empleando una gota del antisuero O en lugar de la solución salina. Si se produce aglutinación, la reacción se considera positiva.
Para fines de vigilancia sanitaria, enviar el cultivo al laboratorio de referencia de la COFEPRIS (CCAYAC) para su identificación serológica o molecular.
A.8. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS.
a) Los cultivos determinados como presuntivos con las pruebas bioquímicas o confirmados por la serología, informar como:
Salmonella spp en 25g: PRESENCIA.
b) Descartar los cultivos con resultados atípicos a partir de las pruebas bioquímicas miniaturizadas clasificadas como no Salmonella, informar:
Salmonella spp en 25g: AUSENCIA.
c) Placas con agar XLD, ASB y EH sin desarrollo y/o colonias atípicas, informar:
Salmonella spp en 25g: AUSENCIA.
d) En caso de que la cantidad sea menor a 25g se debe reportar la presencia o ausencia de Salmonella en la porción de ensayo (g o mL) de producto utilizado.
A.9. AYUDA VISUAL.
A.10. FORMULACIONES Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO.
Alternativamente pueden utilizarse medios comerciales a menos que se indique otra cosa.
La caducidad de los medios de cultivo una vez preparado deberá ser demostrada en el laboratorio bajo las condiciones de almacenamiento particulares, a menos que se indique otra cosa.
A.10.1. Agua peptonada amortiguada.
A.10.1.1. Fórmula.
| Digerido enzimático de caseína NaCl Na2HPO4.12H2O KH2PO4 Agua | 10.0g 5.0g 9.0g 1.5g 1 000mL |
A.10.1.2. Preparación: Disolver los ingredientes en el agua, calentar si es necesario. Ajustar el pH, de tal manera que después de la esterilización sea 7.0 ± 0.2 a 25 °C. Distribuir el medio en frascos de capacidad necesaria para obtener las porciones de prueba. Esterilizar en autoclave 15 min a 121 °C.
A.10.2. Caldo RVS.
A.10.2.1. Solución A.
A.10.2.1.1. Fórmula.
| Digerido enzimático de soya NaCl KH2PO4 K2HPO4 Agua | 5.0g 8.0g 1.4g 0.2g 1000mL |
A.10.2.1.2. Preparación: Preparar por ingredientes y disolverlos en el agua, es necesario calentar aproximadamente a 70 °C. La solución debe prepararse el día de la preparación del medio de RVS completo.
A.10.2.2. Solución B.
A.10.2.2.1. Fórmula.
| MgCl2.6H2O Agua | 400.0g 1000mL |
A.10.2.2.2. Preparación: Disolver el cloruro de magnesio en el agua. Como esta sal es muy higroscópica, es aconsejable disolver el contenido completo de un frasco nuevo de MgCl2.6H2O de acuerdo a la fórmula. Por ejemplo, agregando 250g de MgCl2.6H2O a 625mL de agua, dará un volumen total de solución de 788mL y una concentración de 31.7g por cada 100mL de MgCl2.6H2 aproximadamente.
La solución puede almacenarse en un frasco ámbar con tapa hermética a temperatura ambiente por 2 años.
A.10.2.3. Solución C.
A.10.2.3.1. Fórmula.
| Oxalato de verde malaquita Agua | 0.4g 100mL |
A.10.2.3.2. Preparación: Disolver el oxalato de verde malaquita en el agua. La solución puede almacenarse en frasco ámbar a temperatura ambiente por 8 meses.
A.10.2.4. Medio Completo.
A.10.2.4.1. Fórmula.
| Solución A Solución B Solución C | 1000mL 100mL 10mL |
A.10.2.4.2. Preparación: Agregar 1000mL de la solución A, 100mL de la solución B y 10mL de la solución C. Ajustar el pH, si es necesario, de tal manera que después de la esterilización sea de 5.2 ± 0.2. Antes de su uso, distribuir porciones de 10mL a cada tubo. Esterilizar a 115 °C por 15 min. Almacenar el medio preparado a 3 °C ± 2 °C, utilizar el medio el mismo día de su preparación.
Nota: La composición final del medio completo será de: Digerido enzimático de soya, 4.5g/L; NaCl, 7.2g/L;
KH2PO4 + K2HPO4, 1.44g/L; MgCl2, 13.4g/L o MgCl2.6H2O, 28.6g/L; oxalato de verde malaquita, 0.036g/L.
A.10.3. Caldo MKTTn.
A.10.3.1. Medio Base.
A.10.3.1.1. Fórmula.
| Extracto de carne Digerido enzimático de caseína NaCl CaCO3 Na2S2O3.5H2O Ox sales biliares uso bacteriológico Verde brillante Agua | 4.3g 8.6g 2.6g 38.7g 47.8g 4.78g 0.0096g 1000mL |
A.10.3.1.2. Preparación: Disolver los ingredientes deshidratados básicos de la fórmula o el medio completo deshidratado en el agua, hervir por 5 min. Ajustar el pH, si es necesario, a 8.2 ± 0.2 a 25 °C. El medio base puede almacenarse por 4 semanas a 3 °C ± 2 °C.
A.10.3.2. Solución de YodoâYoduro
A.10.3.2.1. Fórmula.
| Yodo Yoduro de potasio (KI) Agua | 20.0g 25.0g 100.0mL |
A.10.3.2.2. Preparación: Disolver completamente el yoduro de potasio en 10mL de agua, agregar el yodo y diluir a 100mL con agua estéril. No calentar.
Almacenar la solución en la oscuridad a temperatura ambiente en un frasco bien cerrado.
A.10.3.3. Solución de Novobiocina.
A.10.3.3.1. Fórmula.
| Novobiocina (sal sódica) Agua | 0.04g 5.0mL |
A.10.3.3.2. Preparación: Disolver la novobiocina (sal sódica) en el agua y esterilizar por filtración. Puede almacenar la solución por no más de 4 semanas a 3 °C ± 2 °C.
A.10.3.4. Medio Completo.
A.10.3.4.1. Fórmula.
| Medio base Solución de yodo-yoduro Solución de novobiocina | 1000mL 20mL 5mL |
A.10.3.4.2. Preparación: Agregar asépticamente 5mL de solución de novobiocina a 1000mL de medio base. Mezclar, después agregar 20mL de la solución de yodo-yoduro. Mezclar bien. Distribuir el medio asépticamente en recipientes estériles de suficiente capacidad para contener las porciones necesarias de prueba. El medio completo deberá utilizarse el mismo día de la preparación.
A.10.4. Agar XLD.
A.10.4.1. Medio Base.
A.10.4.1.1. Fórmula.
| Extracto de levadura en polvo NaCl Xilosa Lactosa Sacarosa L-Lisina Tiosulfato de sodio Citrato férrico amónico Rojo de fenol Desoxicolato de sodio Agar Agua | 3.0g 5.0g 3.75g 7.5g 7.5g 5.0g 6.8g 0.8g 0.08g 2.5g 15.0g 1000mL |
A.10.4.1.2. Preparación: Disolver los ingredientes básicos deshidratados de la fórmula o el medio completo deshidratado en el agua por calentamiento, con agitación frecuente, hasta que el medio comience a hervir. Evitar el sobrecalentamiento. Ajustar el pH, si es necesario, a 7.4 ± 0.2 a 25 °C.
A.10.4.1.3. Preparación de las placas de agar: Transferir el medio inmediatamente a un baño de agua a 44 °C â 47 °C y esperar a que el medio se atempere, agitar y vaciar en las placas, dejar solidificar. Antes de su uso las placas deberán estar completamente secas, se recomienda secar las placas en horno entre 37 °C y 55 °C con las tapas parcialmente abiertas o en campana de flujo laminar hasta que la superficie del agar este seca. El medio se puede almacenar por no más de 5 días a 3 °C ± 2 °C.
A.10.5. Agar nutritivo.
A.10.5.1. Fórmula.
| Extracto de carne Peptona Agar Agua | 3.0g 5.0g 15.0g 1000mL |
A.10.5.2. Preparación: Disolver los ingredientes o el medio completo deshidratado en el agua, por calentamiento. Si es necesario, ajustar el pH de tal manera que después de la esterilización quede en 6.8 ± 0.2 a 25 °C. Transferir el medio de cultivo a tubos o botellas de capacidad apropiada. Esterilizar por 15min a 121 °C.
A.10.5.2.1. Preparación de las placas de agar nutritivo: Transferir el medio inmediatamente a un baño de agua a 44 °C â 47 °C y esperar a que el medio se atempere, agitar y vaciar 15mL del medio fundido a placas estériles, dejar solidificar. La superficies de las placas debe estar completamente seca antes de su uso, se recomienda secar las placas en un horno entre 37 °C y 55 °C con las tapas parcialmente abiertas o en campana de flujo laminar hasta que la superficie del agar este seca.
A.10.6. Agar TSI.
A.10.6.1. Fórmula.
| Extracto de carne Extracto de levadura Peptona NaCl Lactosa Sacarosa Glucosa Citrato de fierro (III) Tiosulfato de sodio Rojo de fenol Agar Agua | 3.0g 3.0g 20.0g 5.0g 10.0g 10.0g 1.0g 0.3g 0.3g 0.3g 15.0g 1000mL |
A.10.6.2. Preparación: Disolver los ingredientes o el medio completo deshidratado en el agua por calentamiento. Si es necesario, ajustar el pH de tal manera que después de la esterilización quede en 7.4 ± 0.2 a 25 °C. Distribuir 10mL del medio en tubos de ensaye. Esterilizar por 15 min a 121 °C. Dejar solidificar en posición inclinada para obtener un bisel de 2.5cm â 5cm.
A.10.7. Agar Urea de Christensen.
A.10.7.1. Medio Base.
A.10.7.1.1. Fórmula.
| Peptona Glucosa NaCl Fosfato dihidrogenado de potasio (KH2PO4) Rojo de fenol Agar | 1.0g 1.0g 5.0g 2.0g 0.012g 15.0g |
A.10.7.1.2. Preparación: Disolver los ingredientes o el medio completo deshidratado por calentamiento. Si es necesario, ajustar el pH de tal manera que después de la esterilización quede en 6.8 ± 0.2 a 25 °C. Esterilizar por 15 min a 121 °C.
A.10.7.2. Solución de urea.
A.10.7.2.1. Fórmula.
| Urea Agua, para un volumen final de | 400g 1000mL |
A.10.7.2.2. Preparación: Disolver la urea en el agua. Esterilizar por filtración.
A.10.7.3. Medio Completo.
A.10.7.3.1. Fórmula.
| Medio base Solución de Urea | 950mL 50mL |
A.10.7.3.2. Preparación: Agregar bajo condiciones asépticas, la solución de urea al medio base, previamente fundido y mantenido de 44 °C â 47 °C en el baño de agua. Distribuir 10mL del medio completo a tubos de ensaye.
A.10.8. Reactivo de -Galactosidasa.
A.10.8.1. Solución amortiguadora.
A.10.8.1.1. Fórmula.
| NaH2PO4 NaOH, 10mol/L solución Agua, para un volumen final de | 6.9g 3mL 50mL |
A.10.8.1.2. Preparación: Disolver el fosfato dihidrogenado de sodio en 45mL de agua en un matraz volumétrico. Ajustar el pH a 7.0 ± 0.2 a 25 °C con la solución de hidróxido de sodio. Agregar agua para un volumen final de 50mL.
A.10.8.2. Solución de ONPG.
A.10.8.2.1. Fórmula.
A.10.8.2.2. Preparación: Disolver el ONPG en el agua a aproximadamente 50 °C. Enfriar la solución.
A.10.8.3. Reactivo Completo.
A.10.8.3.1. Fórmula.
| Solución amortiguadora Solución de ONPG | 5mL 15mL |
A.10.8.3.2. Preparación: Agregar la solución amortiguadora a la solución de ONPG.
A.10.9. Reactivos para la prueba VP.
A.10.9.1. Medio de VP.
A.10.9.1.1. Fórmula.
| Peptona Glucosa K2HPO4 Agua | 7.0g 5.0g 5.0g 1000mL |
A.10.9.1.2. Preparación: Disolver los ingredientes en agua, calentar si es necesario. Ajustar el pH de tal forma que después de la esterilización quede a 6.9 ± 0.2 a 25 °C. Transferir 3mL de volumen a tubos de ensaye y esterilizar por 15min a 121 °C.
A.10.9.2. Solución de creatinina (N-amidinosarcosina).
A.10.9.2.1. Fórmula.
| Monohidrato de creatinina Agua | 0.5g 100mL |
A.10.9.2.2. Preparación: Disolver el monohidrato de creatinina en el agua.
A.10.9.3. 1-naftol, solución etanólica
A.10.9.3.1. Fórmula
| 1-Naftol Etanol al 96% | 6g 100mL |
A.10.9.3.2. Preparación: Disolver el 1-naftol en el agua.
A.10.9.4. Solución de KOH.
A.10.9.4.1. Fórmula.
A.10.9.4.2. Preparación: Disolver el KOH en el agua.
A.10.10. Reactivos para la reacción de Indol.
A.10.10.1. Medio Triptona/triptófano.
A.10.10.1.1.Fórmula.
| Triptona NaCl DL-Triptófano Agua | 10g 5g 1g 1000mL |
A.10.10.1.2. Preparación: Disolver los ingredientes en el agua hirviendo. En caso necesario, ajustar el pH a 7.5 ± 0.2 a 25 °C. Distribuir volúmenes de 5mL del medio a tubos de ensaye. Esterilizar 15 min a 121 °C.
A.10.11. Reactivo de Kovacs.
A.10.11.1. Fórmula.
| 4-Dimetilaminobenzaldehido Ácido hidroclórico, r = 1.18 g/mL a 1.19 g/mL 2-metilbutan-ol | 5g 25mL 75mL |
A.10.11.2. Preparación: Mezclar los componentes.
A.10.12. Solución Salina Fisiológica.
A.10.12.1. Fórmula.
A.10.12.2. Preparación: Disolver el cloruro de sodio en el agua. Si es necesario, ajustar el pH de tal manera que después de la esterilización quede en 7.0 ± 0.2 a 25 °C. Distribuir volúmenes de la solución tal que después de la esterilización queden entre 90mL a 100mL. Esterilizar 15 min a 121 °C.
A.10.13. Agar EH.
A.10.13.1. Fórmula.
| Peptona | 12g |
| Extracto de levadura | 3g |
| Sales biliares No. 3 | 9g |
| Lactosa | 12g |
| Sacarosa | 12g |
| Salicina | 2g |
| NaCl | 5g |
| Tiosulfato de sodio | 5g |
| Citrato férrico amónico | 1.5g |
| Azul de bromotimol | 0.065g |
| Fucsina ácida | 0.1g |
| Agar | 14.0g |
| Agua destilada | 1L |
| pH final 7.5 ± 0.2 |
A.10.13.2. Preparación: Calentar a ebullición con agitación frecuente para disolver los ingredientes por no más de 1 min. No sobrecalentar. Enfriar a 45-50 °C. Distribuir en porciones de 20mL en cajas Petri de 15 x 100mm. Dejar secar por 2h con las tapas parcialmente abiertas. Almacenar hasta 30 días en refrigeración (4 ± 2 °C).
A.10.14. Agar ASB.
A.10.14.1. Fórmula.
| Polipeptona (o peptona) | 10g |
| Extracto de carne | 5g |
| Dextrosa | 5g |
| Na2HPO4 (anhidro) | 4g |
| FeSO4 (anhidro) | 0.3g |
| Sulfito de bismuto (indicador) | 8g |
| Verde brillante | 0.025g |
| Agar | 20g |
| Agua destilada pH, 7.7 ± 0.2 | 1L |
A.10.14.2. Preparación: Mezclar los ingredientes con calentamiento y agitación constante a ebullición por 1min hasta obtener una suspensión uniforme (el precipitado no se disuelve). Enfriar a 45-50 ºC. Suspender el precipitado con agitación suave y distribuir volúmenes de 20mL en cajas Petri estériles de 15 X 100mm. Permitir que seque el agar por 2h con las tapas parcialmente abiertas y después cerrarlas.
PRECAUCIÓN: No esterilizar. Preparar el medio un día antes de su uso y almacenar en oscuridad. El medio pierde selectividad después de 48h.
Apéndice Normativo B.
Método de referencia para la estimación de la cuenta de Staphylococcus aureus.
Se establece el método microbiológico para determinar la cuenta de S. aureus presente en alimentos para consumo humano nacionales o de importación.
B.1. INTRODUCCIÓN.
B.2. S. aureus es una bacteria altamente vulnerable a tratamientos térmicos y a varios agentes sanitizantes. La presencia de esta bacteria en los alimentos procesados o en los equipos donde se procesan,
es generalmente un indicador de sanitización inadecuada. S. aureus produce enterotoxinas que al ingerirse pueden causar intoxicaciones alimentarias. Es actualmente responsable de un alto porcentaje de los brotes de intoxicación alimentaria a nivel mundial.
Para el propósito del presente método, la confirmación de S. aureus está basado en una fuerte reacción de coagulasa, pero se reconoce que hay algunas cepas de S. aureus que producen una reacción débil. Estas últimas cepas se pueden confundir con otras bacterias, pero se pueden distinguir por medio del uso de pruebas adicionales, como son la termonucleasa y producción de ácido a partir del manitol, entre otras.
Este método permite hacer una estimación del contenido de S. aureus en los productos de consumo, se efectúa directamente en placas de medio de cultivo selectivo y diferencial, con la confirmación mediante las pruebas de coagulasa como determinante y pruebas auxiliares cuando la determinación de la coagulasa es débil.
B.3. EQUIPO.
B.3.1 Horno para esterilizar que alcance 180 °C.
B.3.2 Autoclave.
B.3.3 Balanza con capacidad no mayor de 2,500g y sensibilidad de 0.1g.
B.3.4 Incubadora a capaz de operar a 35 °C ± 1 ºC.
B.3.5 Homogeneizador peristáltico tipo Stomacher.
B.3.6 Baño de agua capaz de operar a 35 °C ± 1 ºC.
B.4. MATERIALES.
B.4.1 Cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas.
B.4.2 Tubos de cultivo de 16mm x 150mm o frascos de 125 a 250mL de capacidad.
B.4.3 Tubos de cultivo de 10mm x 75mm.
B.4.4 Cajas Petri de 90 a 100mm de diámetro.
B.4.5 Pipetas bacteriológicas de 1mL y 10mL de capacidad graduadas en 0.1mL y 1mL respectivamente y diámetro de 2 a 3mm.
B.4.6 Pipetas Pasteur.
B.4.7 Probetas.
B.4.8 Varillas de vidrio de 3.5mm de diámetro aproximadamente y 20cm de largo dobladas en ángulo recto u equivalente.
B.4.9 Matraz Erlenmeyer.
B.4.10 Cámara húmeda: consiste en una caja Petri en la cual se coloca una varilla de vidrio en forma de "V" rodeada de algodón humedecido con agua.
B.5. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS.
B.5.1 Agar Baird Parker.
B.5.2 Solución de telurito de potasio.
B.5.3 Emulsión de yema de huevo (puede usarse comercialmente preparada).
B.5.4 BHI.
B.5.5 Solución reguladora de fosfatos.
B.5.6 Agua peptonada.
B.5.7 Solución Salina 0.85%.
B.5.8 Agar Azul de Toluidina-ADN.
B.5.9 Plasma de Conejo con EDTA.
B.5.10 Agar Soja Tripticaseina.
B.5.11 Peróxido de hidrógeno al 3%.
B.5.12 AST.
B.5.13 Reactivos para la tinción de Gram.
B.5.14 Caldo rojo de fenol (glucosa y manitol).
B.5.15 Solución de Piruvato de Sodio.
B.5.16 Aceite de parafina o mineral estéril.
B.5.17 S. aureus.
B.5.18 S. epidermidis.
B.5.19 Solución trazable para calibración de potenciómetro (CENAM).
B.6. CONDICIONES DE PRUEBA.
B.6.1 Preparación de la muestra.
Tomar diferentes porciones del alimento, transferir 25g o mL a frascos de dilución con 225mL de solución reguladora de fosfatos, para preparar una dilución 1:10.
En una situación atípica y justificada, si la porción de muestra utilizada en el ensayo es distinta a 25g, se deberá utilizar la cantidad necesaria de solución reguladora de fosfatos, para obtener una dilución 1:10.
Homogeneizar por 1 o 2 min en licuadora o Stomacher dependiendo del tipo de alimento.
B.6.2 Preparación de la muestra para Moluscos en concha
Como se indica en A.6.2.4.
B.6.3 Procedimiento para Moluscos, desconchados y congelados.
Como se indica en A.6.2.5
B.6.4 Productos de la pesca.
Pesar 200g del alimento en 200mL de regulador de fosfatos (dilución 1:2) y homogeneizar por 2 min en vaso de licuadora u homogeneizador peristáltico, el volumen total en el vaso debe cubrir totalmente las aspas. Las muestras congeladas deben descongelarse en refrigeración (2 ºC - 5 ºC) un máximo de 18h antes de su análisis.
B.7. PROCEDIMIENTO ANALÍTICO.
B.7.1 Transferir por medio de una pipeta estéril, 0.1mL de la muestra directa si es líquida, o 0.1mL de la suspensión inicial (dilución 10-1) en el caso de otros productos, por duplicado a cajas de agar Baird Parker. Repetir el procedimiento para las diluciones siguientes si son necesarias 10-2, 10-3.
Nota: Si se sospecha que el alimento contiene bajas cuentas de S.aureus, se deberá aumentar el límite de detección, en un factor igual a 10 inoculando 1mL de la muestra directa si ésta es líquida, o de cada dilución distribuida en 3 placas como sigue: 0.4, 0.3 y 0.3mL sobre la superficie de las placas de agar Baird-Parker, por duplicado. En ambos casos evitar usar cajas húmedas.
B.7.2 Cuidadosamente distribuir el inóculo tan pronto como sea posible, sobre la superficie del agar con varillas estériles de vidrio en ángulo recto, utilizando una para cada placa y dilución.
B.7.3 Mantener las placas con las tapas hacia arriba hasta que el inóculo sea absorbido totalmente por el agar.
B.7.4 Invertir las placas e incubar por 24 a 35 ºC ± 1 ºC, marcar las colonias típicas observadas. Morfología colonial típica colonias negras, circulares, brillantes, convexas, lisas, de diámetro de 1 a 2mm y muestran una zona opaca, húmedas y con un halo claro (de proteólisis) alrededor de la colonia. Reincubar las placas a 35 ºC ± 1 ºC, por otras 22 a 24h y marcar las nuevas colonias típicas.
NOTA: En algunas ocasiones cepas que han sido aisladas de productos congelados o deshidratados que han sido almacenados por periodos largos de tiempo, frecuentemente desarrollan colonias menos negras con
apariencia rugosa y textura seca. Las colonias atípicas son similares en apariencia pero sin halo claro alrededor.
B.7.5 Seleccionar las placas que tengan entre 15 y 150 colonias típicas y atípicas de S. aureus; si no es posible, seleccionar las placas de las diluciones más altas no obstante tengan más de 150 colonias. Seleccionar de cada placa 5 colonias típicas y 5 colonias atípicas, para su confirmación.
B.7.6 Cuando las placas tengan menos de 15 colonias típicas se debe agregar la nota de "valor estimado" al reporte de los resultados.
B.7.7 Si fue inoculado 1.0mL en 3 placas, tratar éstas como una sola y seguir los procedimientos de confirmación.
B.7.8 Confirmación: Prueba de Coagulasa.
B.7.8.1 Seleccionar y sembrar cada colonia típica en tubos con 0.5mL de BHI y en tubos con AST. Utilizar simultáneamente un control positivo de S. aureus y un control negativo de S. epidermidis. Incubar a 35 ºC ± 1 ºC en baño de agua, durante 20 a 24h. Mantener los cultivos en AST a no más de 27 ºC ± 1 ºC para pruebas posteriores. Agregar a 0.1mL del cultivo anterior a 0.3mL de plasma de conejo con EDTA (a menos que el fabricante indique otras cantidades). Incubar a 35 °C ± 1 ºC en baño de agua y observar periódicamente a intervalos de 1h durante las primeras 4 a 6h; si no hay formación de coágulo, observar hasta las 24h. Considerar la prueba positiva cuando el coágulo se forma completamente y es firme al invertir el tubo. En otro caso se deberán realizar las pruebas auxiliares.
B.7.8.2 Nota: Para cada reactivo nuevo se deberá realizar la prueba de coagulabilidad del plasma de conejo añadiendo una gota de calcio al 5% a 0.5mL de plasma reconstituido, formándose un coágulo en 10-15 seg.
B.7.9 Pruebas auxiliares.
B.7.9.1 Realizar una tinción de Gram a cada cultivo observar al microscopio y observar la presencia de cocos Gram positivos.
B.7.9.2 Si se dispone de un sistema de bioquímicas miniaturizado, éste puede ser utilizado como alternativa de las siguientes pruebas, con excepción de la termonucleasa y la tinción de Gram.
B.7.9.3 Prueba de catalasa. A partir de un cultivo en AST realizar la prueba de la catalasa en un portaobjetos, emulsificar una porción del cultivo con 1 gota de peróxido de hidrógeno al 3%. Observar la producción de burbujas de gas.
B.7.9.4 Utilización anaeróbica del manitol. Inocular un tubo con caldo para la fermentación adicionado de manitol al (0.5%), con un inóculo abundante. Cubrir el caldo con una capa de aceite de parafina o aceite mineral de al menos 25mm. Incubar hasta 5 días a 37 °C ± 1 ºC. Un cambio en la coloración del indicador indica la utilización anaeróbica del manitol y la presencia S. aureus. Incluir los controles positivos y negativos.
B.7.9.5 Utilización anaeróbica de la glucosa. Inocular un tubo con caldo para la fermentación adicionado de glucosa al (0.5%), con un inóculo abundante. Cubrir el caldo con una capa de aceite de parafina o aceite mineral de al menos 25mm. Incubar hasta 5 días a 37 °C ± 1 ºC. Un cambio en la coloración del indicador indica la utilización anaeróbica de la glucosa y la presencia S. aureus. Incluir los controles positivos y negativos.
B.7.9.6 Prueba de termonucleasa. Preparar portaobjetos con 3mL de agar azul de toluidina-ADN. Con ayuda de una pipeta Pasteur hacer orificios equidistantes en el agar. En un baño de agua hirviendo calentar durante 15 min, 0.3 mL de cultivo en BHI. Utilizando una pipeta Pasteur transferir una gota del cultivo a un orificio del medio, repetir para cada cepa incluyendo testigos positivo y negativo. Incubar a 35 ºC ± 2 °C en cámara húmeda de 4 a 24h. La aparición de un halo color rosa extendido de por lo menos 1mm alrededor de la perforación se califica como positiva la prueba.
Tabla B.1. Características de S. aureus, S. epidermidis y Micrococcus.
B.8. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS.
B.8.1. Si al menos el 80% de las colonias típicas seleccionadas fueron coagulasa positiva, tomar el número total de las colonias contadas como presuntivas de S.aureus.
B.8.2. En otros casos, calcular el número de colonias presuntivas de S. aureus a partir del porcentaje obtenido de colonias coagulasa positivas confirmadas.
B.8.3. Promediar los resultados de los duplicados.
B.8.4. Cuando en dos diluciones consecutivas se obtienen cuentas entre 15 y 150 colonias (típicas o atípicas) calcular el número de S. aureus para cada dilución como se especifica en los puntos anteriores, calcular la cuenta de S. aureus considerando el factor de dilución, calcular el logaritmo en base diez de cada dilución y realizar la resta de éstos, si la diferencia entre los logaritmos de las dos diluciones es menor a 0.3, reportar el promedio de las dos diluciones. Si por el contrario la diferencia entre los logaritmos es mayor a 0.3; reportar el valor más bajo.
B.8.5. Cuando no se tenga crecimiento reportar como:
B.8.6. Ejemplo para el cálculo de S. aureus.
Por ejemplo, el 0.1mL del inóculo de la dilución 10-2 de la muestra da como resultado 65 y 85 colonias típicas por placa.
Ninguna colonia atípica fue identificada en las placas.
Todas las 5 colonias seleccionadas de la placa conteniendo 65 colonias fueron coagulasa positiva por lo que las 65 colonias fueron consideradas como S. aureus.
3 de las 5 colonias seleccionadas de la placa que contiene 85 colonias fueron coagulasa positiva por lo que el 60%, es decir, 51 colonias son consideradas como S. aureus.
La cuenta promedio es:
65+51 / 2 = 58 S. aureus.
58 por el inverso del factor de dilución (1/10-2) es 5800 UFC.
Si se considera que el inóculo fue de 0.1mL habrá que multiplicar por 10 para obtener 58000UFC/mL.
B.8.7. Precisión de la cuenta.
Para razones estadísticas, los intervalos de confianza de este método varían en un 95% de los casos,
desde un ±16% a ±52%. En la práctica, una mayor variación se puede encontrar, especialmente entre los resultados obtenidos por diferentes analistas.
B.9. Ayuda Visual.
B.10. Composición y preparación de medios de cultivo y reactivos.
B.10.1 Agar Baird Parker.
B.10.1.1. Medio base.
B.10.1.2. Fórmula.
| Triptona | 1g |
| Extracto de carne | 5g |
| Extracto de levadura | 1g |
| Piruvato de sodio | 1g |
| Glicina | 1g |
| Cloruro de litio .6H2O | 5g |
| Agar | 20g |
| Agua destilada pH final 7.0 ± 0.2. | 1L |
B.10.1.3. Preparación: Disolver los ingredientes en 950mL de agua destilada con agitación constante y calentamiento. Esterilizar 15 min a 121 °C. Si se utiliza inmediatamente, mantenerlo fundido a 48-50 ºC antes de adicionar los ingredientes de enriquecimiento o almacenar el medio solidificado a 4 ± 1 °C hasta 1 mes. Fundir el medio antes de su uso.
Ingredientes de enriquecimiento: telurito y yema de huevo.
Adicionar asépticamente 5mL de yema de huevo-telurito de potasio a temperatura ambiente, a 95mL de la base fundida. Mezclar bien evitando hacer burbujas y vaciar porciones de 15-18mL en cajas Petri 15 x 100mm. El medio debe ser densamente opaco. Secar las placas antes de su uso. Guardar las placas preparadas 20-25 ºC hasta 5 días.
B.10.2 Emulsión de yema de huevo.
B.10.2.1 Preparación. (Sólo si una presentación comercial no está disponible)
Utilizar huevos frescos, separar la yema de la clara.
Mezclar las yemas con 4 veces el volumen de agua, calentar la mezcla en un baño de agua, controlando la temperatura a 45 ± 0.5 °C por 2h y dejar reposar por de 18 a 24h de 0 a +5 °C, dejar precipitar.
Decantar el sobrenadante líquido y esterilizarlo por filtración, a menos que se haya llevado la separación asépticamente. La emulsión puede ser almacenada de 2 a 8 °C por no más de 72h.
B.10.3 Solución de Telurito de potasio.
B.10.3.1 Fórmula.
| Telurito de potasio (trioxotelurito dipotásico) Agua | 1.0g 100mL |
B.10.3.2 Preparación: Disolver el telurito de potasio en agua con un mínimo calentamiento.
Esterilizar por filtración.
La solución puede ser conservada de 2 a 8 °C por seis meses.
B.10.4 BHI.
B.10.4.1 Fórmula.
| Peptona Infusión cerebro de ternero deshidratado Infusión corazón de res deshidratado Glucosa Cloruro de sodio Fosfato disódico Na2HPO4 Agua | 1.0g 100mL 5.0g 2.0g 5.0g 2.5g 1000mL |
B.10.4.2 Preparación: Disolver los componentes o el medio completo comercial en agua hirviendo, ajustar el pH para que después de la esterilización se encuentre entre en 7.4 a 25 °C.
Transferir el contenido a tubos o botellas en cantidades iguales a 10mL. Esterilizar el medio por 20 min a
121 °C.
El medio puede ser almacenado por 6 meses en condiciones de refrigeración de 0 a 5 °C.
B.10.5 Plasma de Conejo.
B.10.5.1. Preparación: Utilizar el plasma de conejo que esté disponible comercialmente y rehidratar de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Adicionar el EDTA, en el plasma hidratado.
Si no encuentra plasma de conejo deshidratado comercial diluir plasma de conejo fresco en una proporción 1:3 con agua estéril.
Antes de su uso probar cada lote de plasma de conejo con cepas positivas, cepas ligeramente positivas de S. aureus y con cepas negativas.
B.10.6 Agar Azul de Toluidina.
B.10.6.1 Fórmula.
| ADN de timo de carnero | 0.3g |
| Agar | 10g |
| CaCl2 (anhidro) | 1.1mg |
| NaCl | 10g |
| Azul de toluidina O | 0.083g |
| Tris (hidroximetil aminometano) | 6.1g |
| Agua destilada pH 9.0 final | 1L |
B.10.6.2. Preparación: Disolver el Tris (hidroximetil aminometano) en 1L de agua destilada. Ajustar el pH a 9.0 adicionar los ingredientes restantes a excepción del azul de toluidina. Calentar a ebullición para disolver el azul de toluidina en el medio. Distribuir en matraces o tubos de ensaye con tapa de rosca. No es necesario esterilizar si se usa inmediatamente. El medio estéril es estable a temperatura ambiente por 4 meses y es satisfactorio después de varios ciclos de fusión.
Este medio se prepara por ingredientes.
B.10.7 Solución Reguladora de Fosfatos.
B.10.7.1. Fórmula.
| Fosfato monopotásico | 34.0g |
| Agua destilada pH final 7.2 ± 0.2 | 1L |
B.10.7.2. Preparación: Disolver el fosfato en 500mL de agua destilada y ajustar el pH a 7.2 con solución de hidróxido de sodio 1N. Llevar a un L con agua destilada. Esterilizar durante 15 min a 121 °C ± 1 °C.
Para diluciones.
Añadir 1.25mL de solución concentrada de reguladora de fosfatos a un L de agua destilada y ajustar el pH a 7.2 distribuir en frascos de dilución en volúmenes de 97mL. Esterilizar a 121 °C ± 1 °C durante 15 min.
B.10.8 AST.
B.10.8.1. Fórmula.
| Tripticasa peptona | 15g |
| Fitona peptona | 5g |
| NaCl | 5g |
| Agar | 15g |
| Agua destilada pH 7.3 ± 0.2 | 1L |
B.10.8.2. Preparación: Suspender los ingredientes en un L de agua destilada. Dejar reposar de 5 a 10 min. Calentar con agitación constante para disolver el agar. Hervir por 1 min. Distribuir en tubos, cajas o matraces. Esterilizar a 121 ºC por 15 min.
Cepas control: E. coli y S. aureus.
B.10.9 Caldo Rojo de Fenol (para fermentación de carbohidratos).
B.10.9.1. Fórmula.
| Tripticasa o proteona peptona No. 3 | 10g |
| NaCl | 5g |
| Extracto de carne (opcional) | 1g |
| Rojo de fenol (7.2 mL de solución de rojo de fenol al 0.25%) | 0.018g |
| Agua destilada pH 7.4 ± 0.2. | 1L |
| Carbohidrato* |
B.10.9.2. Preparación: Disolver los ingredientes sin el carbohidrato, en 800mL de agua destilada con calentamiento y agitación ocasional. Distribuir en volúmenes de 2mL en tubos de 13 X 100mm con campana de Durham. Esterilizar a 121 ºC por 15min y dejar enfriar. Disolver 20g del carbohidrato en 200mL de agua destilada y esterilizar por filtro de membrana, adicionar asépticamente 0.5mL del filtrado a cada tubo con medio esterilizado y enfriado a menos de 45 ºC, agitar suavemente para mezclar.
B.10.10 Aceite de parafina estéril.
Puede esterilizar por filtración en membrana de 0.22 µm
Se recomienda el uso de Unidad de filtración estéril Millex 33mm con membrana MF-Millipore Catálogo SLGS033SS (0.22 µm) o equivalente.
Apéndice Normativo C.
Método de referencia para el aislamiento de L. monocytogenes.
Establece el método microbiológico para determinar la presencia de L. monocytogenes a partir de alimentos para consumo humano nacionales o de importación.
C.1. INTRODUCCIÓN.
El método para detectar la presencia de L. monocytogenes se basa en el aislamiento y la diferenciación de especies de Listeria spp, principalmente por la fermentación de carbohidratos y la actividad hemolítica de los miembros de este género.
L. monocytogenes es una bacteria que se desarrolla intracelularmente y es causante de Listeriosis. Es uno de los patógenos más virulentos causante de infecciones alimentarias, con una tasa de mortalidad entre un 20 a 30%, más alta que casi todas las restantes tóxico infecciones alimentarias. L. monocytogenes es un bacilo corto Gram positivo, que presenta diploformas dispuestas en "V" y anaerobio facultativo capaz de proliferar en un amplio intervalo de temperaturas (1 ° a 45 °C). Es catalasa positiva y no presenta cápsula ni espora. Tiene flagelos perítricos, gracias a los cuales presenta movilidad a 30 °C o menos, pero es inmóvil a 37 °C, temperatura a la cual sus flagelos se inactivan.
Este método permite hacer una estimación del contenido de L. monocytogenes en los productos de consumo, se efectúa por medio de un pre-enriquecimiento selectivo y después su aislamiento en placas de medio de cultivo selectivo y diferencial, con la confirmación mediante pruebas bioquímicas y fisiológicas.
C.2. EQUIPO.
C.2.1. Equipos de esterilización de calor húmedo y calor seco.
C.2.2. Balanza con capacidad no mayor de 2,500g y sensibilidad de 0.1g.
C.2.3. Incubadoras a las diferentes temperaturas: 25 °C ± 1 °C, 30 °C ± 1 °C y 35 °C ±1 °C o 37 °C ± 1 °C. Baño de agua con una temperatura controlada de 47 °C ± 2 °C.
C.2.4. Potenciómetro.
C.2.5. Homogeneizador peristáltico o licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato, con
vasos esterilizables (vidrio o aluminio).
C.3. MATERIALES.
C.3.1. Asa de platino o níquel de Aprox. 3mm de diámetro o 10ml.
C.3.2. Pipetas graduadas o pipetas automáticas, de diferentes capacidades 10mL, 5mL, con divisiones de 0.5mL y 0.1mL respectivamente protegidas con tapón de algodón.
C.3.3. Pipetas de 1mL, con graduaciones de 0.1mL.
C.3.4. Matraces Erlenmeyer de 500mL y/o capacidad apropiada.
C.3.5. Cajas Petri de vidrio o desechables; diámetro 15mm x 100mm y/o de un diámetro mayor 140mm.
C.3.6. Cucharas, bisturíes, cuchillos y pinzas.
C.3.7. Tubos de ensaye de 16mm x 150mm y de 20mm x 100mm.
C.3.8. Tubos para serología de 10mm x 75mm o de 13mm x 100mm.
C.3.9. Gradillas para tubos de ensaye.
C.3.10. Mecheros Bunsen o Fisher.
C.3.11. Todo el material que tenga contacto con las muestras bajo estudio debe esterilizarse mediante: Horno, durante 2h a 170-175 ºC o autoclave, durante 15 min como mínimo a 121 ºC ± 1 ºC.
C.4. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS.
C.4.1. Caldo Fraser medio, con reducción de la concentración de agentes selectivos.
C.4.2. Caldo Fraser, con completa concentración de agentes selectivos.
C.4.3. Agar Oxford.
C.4.4. Agar PALCAM.
C.4.5. TSYA.
C.4.6. CTSYE.
C.4.7. Agar sangre de cordero.
C.4.8. Caldo carbohidrato (ramnosa y xilosa).
C.4.9. Agar movilidad.
C.4.10. Solución de Peróxido de hidrógeno.
C.4.11. PBS.
C.5. CEPAS.
C.5.1. S. aureus ATCC 49444, ATCC 25923, CIP 5710.
C.5.2. R. equi ATCC 6939, NCTC 1621.
C.5.3. L. monocytogenes ATCC 19115.
C.5.4. L. innocua ATCC 33090.
C.5.5. L. ivanovii.
C.6. CONDICIONES DE PRUEBA.
C.6.1. Muestreo.
Es importante que el laboratorio se cerciore de recibir una muestra representativa y que no haya tenido daños o cambios durante el transporte y/o almacenamiento.
El muestreo no es parte del método especificado en el presente método, es recomendable que las partes involucradas en este punto lleguen a un acuerdo al respecto.
C.6.2. Preparación de la muestra.
En general, al preparar la suspensión inicial, tomar diferentes porciones del alimento, transferirlo al Caldo Fraser medio, a fin de obtener una relación 1:10. Pesar 25g o mL a frascos de dilución con 225mL del Caldo Fraser medio, para obtener una dilución 1:10 (masa-volumen o volumen-volumen).
Homogeneizar por 1 o 2 min en licuadora o homogeneizador peristáltico dependiendo del tipo de alimento.
C.7. PROCEDIMIENTO ANALÍTICO.
C.7.1. Enriquecimiento Primario:
Incubar la suspensión inicial (C.6.2) a 30 °C ± 1 ºC por 24h ± 2h.
Nota: una coloración obscura puede aparecer, durante la incubación.
C.7.2. Enriquecimiento Secundario:
Transferir 0.1mL del enriquecimiento primario, después de la incubación inicial por 24h ± 2h, a un tubo conteniendo 10mL del Caldo Fraser.
Incubar el medio inoculado por un total de 48h ± 2h a 37 °C ± 1 °C.
C.7.3. Siembra en medios Selectivos e Identificación.
Después de la incubación, examine el Caldo Fraser para detectar la presencia de L. monocytogenes mediante la observación visual de la hidrólisis de la esculina que al ser positiva obscurece el caldo. Si se tiene cualquier grado de obscurecimiento.
Del primer enriquecimiento selectivo, después de las 24h ± 2h de incubación, inocular 2 placas de agar Oxford y 2 placas de PALCAM por estría cruzada.
Del segundo enriquecimiento incubado a 37 °C ± 1 °C por 48 ± 2h, inocular 2 placas con agar Oxford y 2 placas con PALCAM por estría cruzada.
Invertir las placas e incubar el agar Oxford y PALCAM a 30 °C ± 1 °C y a 37 ± 1 °C.
NOTA: Las placas con agar PALCAM se pueden incubar en condiciones de microaerofilia (CO2 5% -12% O2 5%-15%).
C.7.4. Después de la incubación por 24h; si se observa un crecimiento pobre o si no se observan colonias; volver a incubar por 18h a 24h. Observar las placas para detectar la presencia de colonias presuntivas de Listeria spp.
C.7.5. Colonias Típicas de Listeria spp, en agar Oxford; por lo general crecen a las 24h se observan pequeñas (1mm) grisáceas, rodeadas por un halo oscuro. Después de las 48h de incubación, las colonias se tornan obscuras con posible brillo verdoso con aproximadamente 2mm de diámetro, con halos negros y centros hundidos.
C.7.6. Colonias típicas de Listeria spp en agar PALCAM; para placas incubadas en anaerobiosis dejarlas expuestas las placas al aire por 1h, para que recuperen su color de rosa a púrpura. Después de 24h se observa a Listeria spp. como colonias muy pequeñas grisáceas o un verde olivo de aproximadamente 1.5 a 2mm de diámetro, a veces con centros negros, pero siempre con halos oscuros. Después de 48h las colonias de Listeria spp se observan de color verde de aproximadamente 1.5 a 2mm de diámetro, con el centro hundido y rodeadas de un halo negro.
C.7.7. Pruebas Auxiliares Confirmatorias de Listeria spp.
C.7.7.1. Selección de Colonias para su confirmación: Tomar de cada placa de agares selectivos, 5 colonias sospechosas de Listeria spp. Si se tiene que alguna de las placas tiene menos de 5 colonias presuntivas, tomar para su confirmación todas las colonias que hayan crecido.
C.7.7.2. Aislamiento: Inocular por estría cruzada, para obtener colonias aisladas en cajas con TSYEA. Incubar estas placas en una incubadora a 37 °C ± 2 °C por 18h a 24h o hasta que el crecimiento sea satisfactorio (no más de 72h).
Las colonias típicas se observan de 1mm a 2mm de diámetro, convexas, incoloras y opacas con borde entero. Si no se obtiene un buen aislamiento, proceder a sembrar nuevamente otra colonia sospechosa de los medios selectivos.
C.7.7.3. Luz de Henry: Esta prueba tiene carácter informativo examinar las placas para TSYEA con
colonias típicas, con el sistema óptico Henry se trata de hacer incidir luz transmitida oblicuamente con una lámpara de luz blanca lo suficientemente potente como para iluminar la placa y en un ángulo de 45 °. Las colonias aparecen de color azul-gris a azul. El uso de las colonias de control positivo y negativo es recomendado. La placa puede ser observando a simple vista pero el uso de un microscopio de disección o lupa es preferible.
Nota: La luz de Henry puede ser mejor percibida si el TSYEA es delgado aproximadamente 15mL/placa.
C.7.7.4. Reacción de Catalasa: Tomar una colonia aislada y suspenderla en una gota de solución de peróxido de hidrógeno. La inmediata formación de burbujas indica una reacción positiva.
Precaución: la agitación del reactivo con la suspensión del microorganismo debe hacerse con un asa de plástico o palillo de madera estéril, evitando el contacto del metal con el reactivo.
C.7.7.5. Tinción de Gram: Realizar la tinción de Gram a una colonia aislada obtenida en TSYA, se deberán observar bacilos cortos Gram Positivos.
C.7.7.6. Prueba de Movilidad: Tomar una colonia aislada de TSYA, y suspenderla en un tubo conteniendo CST con extracto de levadura. Incubar a 25 °C ± 1 ºC por 8h a 24h o hasta que se observe el medio turbio. Depositar una gota de este cultivo entre un portaobjetos y cubreobjetos y examinar en el microscopio. Listeria spp. se observan como bacilos cortos con un movimiento giratorio (trumbling). Cultivos incubados a la temperatura de 25 °C ± 1 ºC pueden ser falsos positivos al exhibir dicho movimiento: se recomienda siempre comparar el cultivo de prueba con cepas conocidas de cocos, bacilos largos o cortos con una movilidad rápida de nado y que no es característico de Listeria spp.
C.7.7.6.1. Prueba alternativa de movilidad: utilizando un asa recta, inocular el agar de movilidad picando una colonia obtenida en TSYEA. Incubar por 48h a 25 °C ± 1 ºC. Examinar el crecimiento alrededor de la picadura. Debido al típico movimiento de Listeria spp. da como resultado un crecimiento característico en forma de sombrilla. Si el crecimiento no es suficiente, incubar por 5 días adicionales y observar la picadura al término de ese tiempo.
C.7.8. Confirmación de L. monocytogenes
C.7.8.1. Prueba de hemólisis: Si las características morfológicas y fisiológicas, así como la catalasa son indicativos de Listeria spp, inocular una placa con agar sangre de carnero al 5% para determinar la actividad hemolítica. Las placas de agar sangre no deben presentar agua de condensación en la superficie del medio. Dibujar una cuadrícula de 20 a 25 espacios en el anverso de la placa de agar sangre de carnero al 5%. Tomar una colonia aislada obtenida en TSYA e inocular por picadura un cuadro por cada cultivo a probar. Simultáneamente utilizar cepas control positiva (L. monocytogenes) y negativas (L. innocua). Después de la incubación a 35 °C ± 2 °C por 24h ± 2h, examinar las cepas de prueba y los controles. L. monocytogenes produce una zona ligeramente clara alrededor del punto de la picadura (b-hemólisis); L. innocua no muestra una zona clara alrededor de la picadura. L. ivanovii usualmente se observa una zona ancha, clara y delimitada de b-hemólisis. Examinar las placas con una luz brillante para poder comparar las cepas de prueba con los controles.
C.7.8.2. Utilización de Carbohidratos (ramnosa y xilosa): Utilizando una asa bacteriológica, inocular cada uno de los caldos de carbohidratos a probar usando colonias aisladas en TSYA. Incubar a 35 °C ± 2 °C por 5 días. Una reacción positiva se caracteriza por la producción de ácido y cambio de color a amarillo que ocurre dentro de las primeras 24 a 48h, si después de 48h de incubación no se observa una reacción positiva
clara, dejar incubar hasta 5 días (alternativamente pueden utilizarse sistemas de bioquímicas miniaturizadas o métodos de biología molecular).
C.7.8.3. Prueba de CAMP: En una placa de agar sangre de carnero sembrar una estría de la cepa de S. aureus y otra línea paralela de R. equi, separadas lo suficiente para que entre éstas pueda estriarse la cepa sospechosa de Listeria, sin que lleguen a tocarse entre sí (Ver figura C.1). Simultáneamente probar cepas control: L. monocytogenes, L. innocua y/o L. ivanovii. Incubar las placas a 35 °C ± 2 °C por 12 a 18h. Observar el sinergismo entre las hemólisis de S. aureus, R. equi y Listeria que se manifiesta como una zona hemolítica intensa. La figura C.1. Muestra la disposición de las estrías de los cultivos en una placa de la prueba de CAMP. La hemólisis de L. monocytogenes y Listeria seeligeri se incrementa cerca de la estría de S. aureus y la hemólisis de L. ivanovii se aumenta cerca de la estría de R. equi. Las especies restantes de Listeria no son hemolíticas en esta prueba.
Figura C.1. Inoculación e Interpretación de la prueba de CAMP.
C.8. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS.
C.8.1. Interpretación de las propiedades morfológicas y fisiológicas de las reacciones Bioquímicas.
Todos las especies de Listeria spp son colonias pequeñas, bacilos Gram positivos con movilidad rotativa y catalasa positiva. L. monocytogenes se distingue de otras especies por las características enlistadas en la tabla C.1.
Para fines de vigilancia sanitaria, los aislamientos que sean considerados como L. monocytogenes deben ser enviados al laboratorio de referencia de la COFEPRIS (CCAyAC) para realizar tipificación.
Tabla C.1. Pruebas para la identificación de Listeria spp.
C.8.2. Cultivos Control.
C.8.3. Con el fin de comprobar la habilidad del pre-enriquecimiento y la identificación de Listeria spp, se recomienda analizar junto con la prueba cepas control negativo como S. aureus y positivo como L. monocytogenes.
C.8.4. Expresión de Resultados.
C.8.5. De acuerdo con la interpretación de los resultados, informar la presencia o ausencia de L. monocytogenes en la muestra de ensayo, especificando la masa en g o el volumen en mL de la muestra ensayada.
C.9. Composición y preparación de medios de cultivo y reactivos.
C.9.1. Caldo Fraser Medio.
C.9.1.1. Medio Base.
C.9.1.1.1. Fórmula.
| Peptona de Carne Triptona Extracto de Carne de Res Extracto de Levadura Cloruro de Sodio Fosfato de sodio monobásico di hidratado Fosfato de Potasio di básico Esculina Agua | 5.0g 5.0g 5.0g 5.0g 20.0g 12.0g 1.35g 1.0g 1000mL |
C.9.1.1.2. Preparación: Disolver los componentes de la base en agua, calentando si es necesario. Ajustar el pH, si es necesario para que después de la esterilización el pH se encuentre entre 7.2 ± 0.2 a 25 °C. Dispensar la base en matraces con capacidad apropiada para la prueba. Esterilizar por 15 min en la autoclave a 121 °C.
Nota: Se deberá adicionar la solución de cloruro de litio y la solución de ácido nalidíxico después de la
esterilización del medio base.
C.9.1.2. Solución de Cloruro de litio.
C.9.1.2.1. Fórmula.
| Cloruro de litio Agua | 3.0g 100mL |
C.9.1.2.2. Preparación: Adicionar el cloruro de litio al agua. Esterilizar por filtración.
C.9.1.3. Solución de ácido nalidíxico.
C.9.1.3.1. Fórmula.
| Sales de ácido nalidíxico sódico Solución de Hidróxido de sodio. 0,05 mol/L | 0.1g 10mL |
C.9.1.3.2. Preparación: Disolver las sales de ácido nalidíxico en la solución de hidróxido de sodio. Esterilizar por filtración.
C.9.1.4. Solución de clorhidrato de acriflavina.
C.9.1.4.1. Fórmula.
| Clorhidrato de acriflavina Agua | 0.25g 100mL |
C.9.1.4.2. Preparación: Disolver el clorhidrato de acriflavina en una porción de agua. Esterilizar por filtración.
C.9.1.5. Solución de citrato, amonio hierro III.
C.9.1.5.1. Fórmula.
| Citrato de amonio hierro III Agua | 5.0g 100mL |
C.9.1.5.2. Preparación: Disolver el Citrato de amonio hierro III en el agua. Esterilizar por filtración.
C.9.1.6. Medio Completo.
C.9.1.6.1. Fórmula.
| Medio Base Solución de Cloruro de Litio Solución de ácido nalidíxico Solución de clorhidrato de acriflavina Solución de citrato, amonio hierro III | 100mL 1.0mL 0.1mL 0.5mL 1.0mL |
C.9.1.6.2. Preparación: Agregar las cuatro soluciones por cada porción de 100mL de base inmediatamente antes de usar.
C.9.2. Caldo Fraser.
C.9.2.1. Medio Base.
C.9.2.1.1. Fórmula
| Peptona de Carne Triptona Extracto de Carne de Res Extracto de Levadura Cloruro de Sodio Fosfato de sodio monobásico dihidratado Fosfato de Potasio dibásico Esculina Cloruro de litio Sal de sodio o ácido nalidíxico Agua | 5.0g 5.0g 5.0g 5.0g 20.0g 12.0g 1.35g 1.0g 3.0g 0.02g 1000mL |
C.9.2.1.2. Preparación: Disolver los componentes de la base en agua, puede usarse calentamiento. Ajustar el pH, cuando se requiera para que después de la esterilización el pH se encuentre entre 7.2 ± 0.2 a 25 °C. Dispensar la base en matraces con capacidad apropiada para la prueba. Esterilizar por 15 min en la autoclave a 121 °C.
C.9.2.2. Solución de clorhidrato de acriflavina.
C.9.2.2.1. Fórmula.
| Clorhidrato de acriflavina Agua | 0.25g 100mL |
C.9.2.2.2. Preparación: Disolver el clorhidrato de acriflavina en una porción de agua. Esterilizar por filtración
C.9.2.3. Solución de citrato, amonio hierro III.
C.9.2.3.1. Fórmula.
| Citrato de amonio hierro III Agua | 5.0g 100mL |
C.9.2.3.2. Preparación: Disolver el Citrato de amonio hierro III en el agua. Esterilizar por filtración.
C.9.2.4. Medio Completo.
C.9.2.4.1. Preparación: Antes de usar añadir a cada tubo con 10mL del medio base 0.1mL de las soluciones de Clorhidrato de acriflavina y solución de citrato de amonio hierro III. Mezclar vigorosamente.
C.9.3. Agar Oxford.
C.9.3.1. Agar Base.
C.9.3.1.1. Fórmula.
| Peptonas Almidón Cloruro de sodio Extracto de Levadura Agar D-glucosa D-manitol Esculina Citrato de amonio, hierro III Rojo de Fenol Cloruro de Litio Agua | 23.0g 1.0g 5.0g 3.0g De 9 a 18g(1) 0.5g 10.0g 0.8g 0.5g 0.08g 15.0g 960mL |
| (1) Dependiendo de la fuerza gel del agar. | |
C.9.3.1.2. Preparación: Disuelva los componentes o el medio deshidratado completo en agua hirviendo. Ajuste el pH si es necesario para que después de la esterilización el pH se encuentre entre 7.2 ± 0.2 a 25 °C. Esterilizar por 15 min en la autoclave a 121 °C.
C.9.3.2. Suplemento para 1000mL del Agar Oxford.
C.9.3.2.1. Fórmula.
| Cicloheximida Sulfato de Colistina Clorhidrato de Acriflavina Cefotetán Fosfomicina Etanol Agua | 400mg 20mg 5.0mg 2.0mg 10mg 5.0mL 5.0mL |
C.9.3.2.2. Preparación: Disuelva los componentes o el medio deshidratado completo en una mezcla de etanol-agua. Esterilizar por filtración.
C.9.3.3. Medio completo.
C.9.3.3.1. Preparación: Enfriar la base a aproximadamente 47 °C y agregue el suplemento asépticamente. Vierta el medio en cajas Petri, en aproximadamente 15mL. Almacene el medio en oscuridad, evite el contacto con la luz.
C.9.4. Agar PALCAM.
C.9.4.1. Agar Base.
C.9.4.1.1. Fórmula.
| Peptona de Carne Triptona Extracto de Carne de Res Extracto de Levadura Cloruro de Sodio Fosfato de sodio monobásico dihidratado Fosfato de Potasio dibásico Esculina Cloruro de litio Sal de sodio o ácido nalidíxico Agua | 5.0g 5.0g 5.0g 5.0g 20.0g 12.0g 1.35g 1.0g 3.0g 0.02g 1000mL |
C.9.4.1.2. Preparación: Disolver los componentes de la base en agua, calentando si es necesario. Ajustar el pH, si es necesario para que después de la esterilización el pH se encuentre entre 7.2 ± 0.2 a 25 °C. Dispensar la base en matraces con capacidad apropiada para la prueba. Esterilizar por 15 min en la autoclave a 121 °C.
C.9.4.2. Solución de Sulfato de Polimixina B.
C.9.4.2.1. Fórmula.
| Sulfato de Polimixima B (100, 000 UI) Agua | 0.1g 100mL |
C.9.4.2.2. Preparación: Disolver el Sulfato de Polimixina B en agua. Esterilizar por filtración.
C.9.4.3. Solución de Clorhidrato de Acriflavina.
C.9.4.3.1. Fórmula.
| Clorhidrato de Acriflavina Agua | 0.05g 100mL |
C.9.4.3.2. Preparación: Disolver el Clorhidrato de Acriflavina en agua. Esterilizar por filtración.
C.9.4.4. Solución de Ceftazidima Sódica Pentahidratada.
C.9.4.4.1. Fórmula.
| Ceftazidima sódica Pentahidratada Agua | 0.116g 100mL |
C.9.4.4.2. Preparación: Disuelva la ceftazidima sódica Pentahidratada en agua. Esterilice por filtración.
C.9.4.5. Medio completo.
C.9.4.5.1. Fórmula.
| Base Agar PALCAM Solución de sulfato de polimixina B Solución de Clorhidrato de Acriflavina Solución de Ceftazidima sódica pentahidratada | 960mL 10mL 10mL 2 mL |
C.9.4.5.2. Preparación: A la base de agar fundida a 45 °C agregar las 3 soluciones, mencionadas en la fórmula, mezclar vigorosamente entre cada adición. Para la preparación en placa añadir al número apropiado de cajas Petri aproximadamente 15mL del medio completo recién preparado, permita solidificar. Almacene el medio lejos de la luz.
C.9.5. Agar TSYE.
C.9.5.1. Fórmula.
| Caldo triptona soya (1) Extracto de levadura Agar Agua | 30g 6.0g de 9 a 18g(2) 1000mL |
| Triptona Peptona de Soya Cloruro de sodio Fosfato de potasio Glucosa Dependiendo de la fuerza del agar | 17.0g 3.0g 5.0g 2.5g 2.5g |
C.9.5.2. Preparación: Disuelva los componentes o el medio completo deshidratado en agua hirviendo. Ajustar el pH si es necesario a modo que después de la esterilización sea de 7.3 ± 0.2 a 25 °C. vierta el medio en tubos de capacidad apropiada, para las pruebas. Esterilice por 15 min en autoclave a 121 °C. Colocar los tubos en una posición inclinada. Dispensar en cajas Petri aproximadamente 15mL y dejar solidificar.
C.9.6. CTSYE.
C.9.6.1. Fórmula.
| Caldo triptona soya (1) Extracto de levadura Agua | 30g 6.0g 1000mL |
| Triptona Peptona de Soya Cloruro de sodio Fosfato de potasio Glucosa | 17.0g 3.0g 5.0g 2.5g 2.5g |
C.9.6.2. Preparación: Disuelva los componentes o el medio completo deshidratado en agua hirviendo. Ajustar el pH si es necesario a modo que después de la esterilización sea de 7.3 ± 0.2 a 25 °C. Vierta el medio en matraces, frascos o tubos de capacidad apropiada para las pruebas. Esterilice por 15 min en autoclave a 121 °C.
C.9.7. Agar Sangre de cordero.
C.9.7.1. Fórmula.
| Peptona de carne Digerido de hígado Extracto de levadura Cloruro de sodio Agar Agua Sangre de Cordero Desfibrada | 15g 2.5g 5g 5g de 9 a 18g(1) 1000mL 100mL |
| (1) Dependiendo de la fuerza del agar | |
C.9.7.2. Preparación: Disuelva los componentes en agua hirviendo con excepción de la sangre. Ajustar el pH si es necesario a modo que después de la esterilización sea de 7.2 ± 0.2 a 25 °C vierta el medio en matraces de capacidad apropiada, para las pruebas. Esterilice por 15 min en autoclave a 121 °C. Agregar la sangre desfibrinada a la base previamente atemperada a 47 °C, mezclar bien. Vierta el medio en cajas Petri en proporciones adecuadas para las pruebas, permita solidificar.
C.9.8. Caldo Carbohidratos (Ramnosa y Xilosa).
C.9.8.1. Medio Base.
C.9.8.1.1. Fórmula.
| Proteasa de Peptona Extracto de Carne Cloruro de sodio Purpura de Bromocresol Agua | 10g 1g 5g 0.02g 1000mL |
C.9.8.1.2. Preparación: Disuelva los componentes en agua, calentar si es necesario. Ajustar el pH a modo que después de la esterilización sea de 6.8 ± 0.2 a 25 °C. Vierta el medio en tubos de capacidad apropiada, para las pruebas. Esterilice por 15 min en autoclave a 121 °C.
C.9.8.2. Solución de Carbohidrato.
C.9.8.2.1. Fórmula.
| Carbohidrato (L-Ramnosa o D-Xilosa) Agua | 5g 100mL |
C.9.8.2.2. Preparación: Disuelva por separado cada carbohidrato en 100mL de agua, esterilizar por filtración.
C.9.8.3. Medio Completo.
C.9.8.3.1. Preparación: En condiciones asépticas para cada carbohidrato agregue xmL de solución del carbohidrato a 9xmL de la base.
C.9.9. Agar de Movilidad.
C.9.9.1. Fórmula.
| Peptona de Caseína Peptona de Carne Agar Agua | 20.0g 6.1g 3.5g 1000mL |
C.9.9.2. Preparación: Disuelva los componentes en agua hirviendo. Ajustar el pH si es necesario a modo que después de la esterilización sea de 7.3 ± 0.2 a 25 °C. Vierta el medio en tubos en cantidades de 5mL y esterilice por 15 min en autoclave a 121 °C.
C.9.10. Solución de Peróxido de Hidrógeno.
C.9.10.1. Preparación: Utilizar 10 volúmenes de solución al 3% masa / masa
C.9.11. PBS.
C.9.11.1. Fórmula.
| Fosfato de Sodio monobásico Dihidratado Fosfato de sodio Dibásico Cloruro de Sodio Agua | 8.98g 2.71g 8.5g 1000mL |
C.9.11.2. Preparación: Disuelva los componentes en agua. Ajustar el pH si es necesario a modo que después de la esterilización sea de 7.2 ± 0.2 a 25 °C. Esterilizar por 15 min en autoclave a 121 °C.
Apéndice Normativo D.
Método alternativo para el recuento de Enterococos en agua.
D.1. INTRODUCCIÓN.
Este grupo fue separado del resto de los estreptococos fecales debido a que son relativamente específicos para la contaminación fecal. Sin embargo, algunos enterococos intestinales aislados de agua, pueden ocasionalmente tener un origen de otras fuentes, incluyendo suelos aun en ausencia de contaminación fecal. El grupo enterococo intestinal puede ser usado como un índice de contaminación fecal.
Los enterococos intestinales son relativamente tolerantes al cloruro de sodio y pH alcalino. La mayoría de las especies no se multiplican en agua. La ventaja de este grupo es su tendencia a sobrevivir en medios acuáticos más que E. coli, son más resistentes a la desecación y a la clorinación.
La presencia de enterococos intestinales evidencia una contaminación fecal reciente, así como la necesidad de llevar a cabo acciones en aquellas fuentes de abastecimiento con un inadecuado tratamiento de potabilización.
En la presente norma se describen tres técnicas para cuantificar y estimar la presencia de enterococos en agua para uso y consumo humano, agua envasada y hielo, agua de uso recreativo (dulce y salobre): 1. Técnica de filtración por membrana, 2. Técnica del número más probable y 3. Técnica del sustrato cromogénico definido.
Es un método de estimación probabilística de la densidad bacteriana presente en una muestra, basada en la dilución de la misma y sembrada en réplicas de tubos con caldo selectivo (caldo azida dextrosa), en los cuales después de un período de incubación de 24h - 48h a 35 ° C ± 0.5 °C, se observa la presencia de turbiedad en cada tubo.
La prueba confirmativa consiste en sembrar cada uno de los tubos que presenten turbiedad, en medio selectivo para enterococos de Pfizer. Después de un periodo de incubación, las colonias de color café a negro y un halo café debido a la hidrólisis de la esculina, son sembradas en caldo BHI con 6.5% de NaCl e incubadas a 45 °C ± 0.5 °C. El desarrollo en este medio confirma la presencia de enterococos.
D.2. MATERIALES.
D.2.1. Botellas de dilución de vidrio de boro silicato o frascos de polipropileno.
D.2.2. Pipetas serológicas de 10mL.
D.2.3. Pipetas serológicas de 1mL.
D.2.4. Asas bacteriológicas.
D.2.5. Tubos de ensaye de 16 x 150mm con tapón de rosca.
D.2.6. Cajas Petri de vidrio de borosilicato o plástico estériles de 100 X 150mm.
D.2.7. Propipeta.
D.2.8. Gradillas.
D.3. APARATOS E INSTRUMENTOS.
D.3.1. Incubadora que evite variaciones mayores de ± 0.5 ºC con termómetro calibrado o verificado.
D.3.2. Autoclave.
D.3.3. Balanza granataria con sensibilidad de al menos 0.1g.
D.4. MEDIOS DE CULTIVO.
D.4.1. Caldo Azida Dextrosa.
D.4.2. ASPE
D.4.3. BHI
D.5. PROCEDIMIENTO ANALÍTICO.
D.5.1. MEDIDAS DE SEGURIDAD.
Seguir las indicaciones precautorias que se señalan en el apartado de preparación de medios de cultivo.
D.5.2. MEDIDAS DE CONTROL DE CALIDAD.
El laboratorio debe tener implementado un sistema de control de calidad para asegurar que los materiales, equipos, reactivos, medios de cultivo y técnicas sean adecuados para la prueba.
D.5.3. ÍNDICES DE REPRODUCIBILIDAD Y REPETIBILIDAD.
Basado en una distribución normal, el 95% de las medias de cada grupo de resultados analíticos deben estar entre +2 y -2 desviaciones estándar con respecto a la media de las medias.*
La precisión del analista deberá estar dentro de un 5%*.
*Fuente: Manual of food quality control12. Quality assurance in the food control microbiological laboratory. Food and Agriculture Organization. FAO.
D.5.4. RECOMENDACIONES GENERALES PREVIAS AL ANÁLISIS DE LA MUESTRA.
Homogeneización de la muestra.- Las muestras en frascos con un espacio vacío (de al menos 2.5cm), pueden homogeneizarse por inversión rápida 25 veces. Las muestras en frascos que tengan de â a ¾ de lleno, deberán agitarse 25 movimientos de arriba abajo en un arco de 30cm completados en un tiempo de 7seg, para asegurar una unidad analítica representativa.
D.5.5. CONDICIONES DE PRUEBA.
Trabajar en condiciones asépticas en un área limpia y descontaminada. Todo el material que esté en contacto con la muestra debe estar estéril.
D.5.6. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA.
Descontaminar el exterior de los contenedores de la muestra con etanol o isopropanol al 70%. Realizar diluciones decimales cuando se estime que la carga de enterococos es alta.
D.5.7. Prueba presuntiva.
D.5.7.1. El tamaño de la porción de muestra analizada dependerá de su tipo (agua para uso y consumo humano, agua envasada y hielo). Utilizar 5 porciones de 20mL o 10 porciones de 10mL inoculados a tubos con caldo azida dextrosa (consultar la sección de medios de cultivo para las concentraciones). Incubar a 35 °C ± 0.5 °C por 24h a 48h. La presencia de turbiedad en los tubos debida al desarrollo microbiano, se considera como prueba presuntiva positiva.
D.5.8. Prueba confirmativa.
D.5.8.1. A partir de los tubos con turbiedad, transferir una asada a placas de ASPE. Incubar las placas invertidas a 35 °C ± 0,5 °C por 24h. El desarrollo de colonias de color café oscuro a negro con halos cafés, confirman la presencia de estreptococos fecales. Transferir las colonias características a tubos con caldo BHI con 6,5% de NaCl. Incubar a 45 °C ± 0.5 °C. El crecimiento en este medio confirma la presencia de enterococos.
D.5.9. Cálculos.
D.5.9.1. Calcular la densidad de Enterococos por el número más probable en 100mL con el número de tubos confirmados consultando las tablas 1 o 2.
Referencia: American Public Health Association. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 21th edition 2005. Washington DC.
Referencia: American Public Health Association. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 21th edition 2005. Washington DC.
D.5.9.2. Considerar en el resultado final la(s) dilución(es) realizadas, cuando proceda.
D.5.9.3. Para el caso de agua para uso recreativo utilizar 5 tubos con caldo azida dextrosa por cada porción de 10mL, 1mL y 0,1mL de muestra. Para inóculos de 10mL de agua, preparar el medio a doble concentración y para volúmenes de 1mL y 0.1mL a concentración sencilla. Hacer diluciones decimales de la muestra cuando se considere necesario con solución reguladora de fosfatos o agua peptonada. Incubar a 35 °C ± 0.5 °C por 24h a 48h. La presencia de turbiedad en los tubos debida al desarrollo microbiano, se considera como prueba presuntiva positiva. Continuar como se indica para la prueba confirmativa.
D.5.9.4. Calcular la densidad de Enterococos por el número más probable en 100mL con el número de tubos confirmados consultando la tabla D.3.
Tabla No. D.3 NMP para 100mL de muestra cuando se usan 5 porciones en cada una de 3 diluciones con series geométricas.
| No. de Tubos Positivos
| No. de Tubos Positivos
| No. de Tubos Positivos
| No. de Tubos Positivos
| No. de Tubos Positivos
| No. de Tubos Positivos
|
| 10mL
| 1 mL
| 0.1mL
| NMP
| 10mL
| 1 mL
| 0.1mL
| NMP
| 10mL
| 1 mL
| 0.1mL
| NMP
| 10mL
| 1 mL
| 0.1mL
| NMP
| 10mL
| 1 mL
| 0.1mL
| NMP
| 10mL
| 1 mL
| 0.1mL
| NMP
|
| 0
| 0
| 0
| <1,8
| 1
| 0
| 0
| 2
| 2
| 0
| 0
| 4,5
| 3
| 0
| 0
| 7,8
| 4
| 0
| 0
| 13
| 5
| 0
| 0
| 23
|
| 0
| 0
| 1
| 1,8
| 1
| 0
| 1
| 4
| 2
| 0
| 1
| 6,8
| 3
| 0
| 1
| 11
| 4
| 0
| 1
| 17
| 5
| 0
| 1
| 31
|
| 0
| 0
| 2
| 3,6
| 1
| 0
| 2
| 6
| 2
| 0
| 2
| 9,1
| 3
| 0
| 2
| 13
| 4
| 0
| 2
| 21
| 5
| 0
| 2
| 43
|
| 0
| 0
| 3
| 5,4
| 1
| 0
| 3
| 8
| 2
| 0
| 3
| 12
| 3
| 0
| 3
| 16
| 4
| 0
| 3
| 25
| 5
| 0
| 3
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